El análisis de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) es la prueba estándar oro para detectar variaciones en el número de copias (CNVs), como grandes deleciones y duplicaciones de exones. Los análisis de MLPA pueden indicarse para el diagnóstico de diversas afecciones, desde enfermedades raras, como la Distrofia Muscular de Duchenne, hasta cánceres hereditarios.
Sin embargo, incluso las mejores herramientas tienen un talón de Aquiles, como limitaciones metodológicas. El análisis mediante MLPA, por ejemplo, puede dar lugar a falsos positivos, lo que puede provocar diagnósticos erróneos.
El Mecanismo: Cuando una base lo cambia todo
El éxito del MLPA depende de la hibridación y ligación perfecta de sus sondas sobre el exón del paciente, para que una enzima ligasa las fusione.
Si existe una variante puntual – mutación de un solo nucleótido, como un polimorfismo benigno/SNV – justo en el sitio donde la sonda debe unirse, la enzima ligasa fallará en su trabajo. Al no haber ligación de las sondas, esa región no se amplifica durante la PCR posterior.
¿El resultado? El software de análisis interpretará la falta de señal como si el exón entero se hubiera perdido, generando un falso positivo de deleción.
Diagnóstico de la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) con MLPA
La ilustración muestra el fallo en la unión de la sonda cuando el exón presenta una mutación puntual. En consecuencia, una parte del ADN no se amplifica en la PCR posterior y el software interpreta el resultado como una deleción (imagen ilustrativa).
La Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es la forma más común y grave de distrofia muscular, y se debe a alteraciones en el gen DMD. El gen DMD es el escenario clínico idóneo para ilustrar este fenómeno. Al ser el gen más grande conocido en humanos (con 79 exones), presenta un perfil mutacional heterogéneo y una alta probabilidad de registrar mutaciones puntuales.
La distribución de las variantes genéticas suele dividirse en:
- Aprox 70% se deben a deleciones de uno o más exones
- 5% – 10% se deben a duplicaciones
- 25% – 30% corresponden a variantes puntuales o pequeños indels
Asghar N. et al. 2018
Debido a la alta prevalencia de deleciones, el MLPA es generalmente la prueba de primera línea para pacientes con sospecha de DMD. El verdadero reto surge cuando el MLPA reporta una deleción de un solo exón (single-exon deletion).
¿Qué tan grande es el riesgo de falso positivo en el caso del MLPA para la Distrofia Muscular de Duchenne?
La literatura médica advierte que las deleciones de un único exón por MLPA deben ser confirmadas por otra metodología. En un estudio de referencia enfocado en la evaluación de estas anomalías en el gen DMD (“Evaluation of Single Exon Deletions in DMD/BMD: Technical and Analytical Concerns”), los investigadores analizaron a pacientes cuyos reportes iniciales de MLPA indicaban la pérdida de un solo exón.
Tras realizar una secuenciación y PCR dirigida de control, se demostró una tasa de falsos positivos del 6,12%. En este porcentaje de pacientes, la supuesta deleción era en realidad una variante puntual localizada exactamente debajo de la sonda de MLPA. Errar en este diagnóstico compromete directamente el pronóstico y el diseño de terapias personalizadas actuales, como el salto de exón (exon skipping) o la lectura de codones de parada.
Mendelics: Exámenes de NGS y MLPA
Como laboratorio pionero en genómica en Latinoamérica, Mendelics ofrece análisis por Secuenciación de Nueva Generación (NGS) y el MLPA.
Para el diagnóstico de la Distrofia Muscular de Duchenne tenemos disponible los exámenes de MLPA para DMD y Secuenciación del gen DMD (NGS) en el Panel de Distrofias Musculares, Miopatías y Miastenia, para médicos que quieran diagnósticos precisos y de alta calidad.
Además, Mendelics también integra flujos para la análisis por Secuenciación de Nueva Generación (NGS) y el MLPA, en un único análisis (NGS + MLPA del gen DMD*):
- Para validar falsos positivos de MLPA mediante NGS: Si el MLPA muestra una deleción sospechosa en un solo exón de DMD, mediante la secuenciación por NGS de alta cobertura, se lee nucleótido por nucleótido el exón en cuestión. Esto permite descifrar si existe la variante puntual encubierta que interrumpió la hibridación de la sonda, reclasificando el hallazgo con total precisión.
- Para cerrar brechas del NGS mediante MLPA: Aunque el NGS es indiscutible para detectar mutaciones puntuales, puede tener menor sensibilidad para definir los puntos de ruptura de grandes reordenamientos o CNVs complejos debido a las lecturas cortas de secuenciación.
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Solo el médico puede determinar cuáles son las pruebas más adecuadas para su paciente, basándose en la sospecha clínica y en los antecedentes familiares del paciente.
Al ofrecer el poder macro del MLPA con la resolución a nivel de una sola base del NGS, Mendelics transforma el diagnóstico molecular robusto y seguro para los pacientes de enfermedades neuromusculares como la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).
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- E-mail: contacto@mendelics.com
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Esta publicación tiene fines educativos. La decisión sobre qué examen realizar a un paciente corresponde exclusivamente al médico que lo solicita.
- Escrito por: Lina Leizano, en junio de 2026
- Revisado por: Agnes Maciel, en junio de 2026
Revisión
El éxito de la prueba MLPA depende de que las sondas se unan perfectamente al ADN del paciente para que la enzima ligasa las fusione. Si existe una variante puntual (como una mutación sin sentido, una mutación de cambio de sentido o un SNP) exactamente en el sitio de unión, se produce un desajuste (mismatch) y la ligasa falla. Como consecuencia, esa región no se amplifica en la PCR posterior y el software interpreta la ausencia de señal como si se hubiera perdido todo el exón, generando un diagnóstico erróneo de deleción.
Un estudio demostró que alrededor del 6.12 % de los informes de MLPA que indican la deleción de un solo exón en el gen DMD son falsos positivos. En estos casos, el paciente no presenta una deleción real, sino una mutación puntual (de una sola base) ubicada exactamente en el sitio de unión de la sonda. Por ello, la literatura médica recomienda que las deleciones de un solo exón se confirmen siempre mediante otra técnica.
Referencias
- Stuppia L., et al. Use of the MLPA assay in the molecular diagnosis of gene copy number alterations in human genetic diseases. 2012. Int J Mol Sci, vol. 13.
- Sait H., et al. Validation of MLPA-detected Single Exon Deletion of the DMD Gene by Multiplex PCR. 2023. [Revista no especificada].
- Chen C., et al. Screening of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) Mutations and Investigating Its Mutational Mechanism in Chinese Patients. 2014. PLoS ONE, vol. 9.
- Asghar Nasir Z., et al. Prenatal Diagnosis of Dystrophin Gene Mutations using Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification (MLPA) for Duchene Muscular Dystrophy. 2018. Biomedical Journal of Scientific & Technical Research, vol. 12.
- Chen Q., et al. Molecular Genetic Analysis of a DMD Frameshift Mutation in a Boy with Duchenne Muscular Dystrophy by MLPA and Sanger Sequencing. 2025. Pharmgenomics Pers Med, vol. 18.
- Janssen B., et al. MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls. 2005. Neurogenetics, vol. 6.
- Dama T., et al. Evaluation of Single Exon Deletions in DMD/BMD: Technical and Analytical Concerns. 2022. Neurol India, vol. 70.
- Ji X., et al. MLPA Application in Clinical Diagnosis of DMD/BMD in Shanghai. 2015. J Clin Lab Anal, vol. 29.
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