Entenda as vantagens do sequenciamento Nanopore para a medicina.

A tecnologia Nanopore é a terceira geração da técnica de sequenciamento que aumenta em milhões de vezes a capacidade de análise do genoma humano e reduz o custo e tempo de sequenciamento.

A metodologia de sequenciamento Nanopore utiliza nanoporos para identificar diretamente as bases do DNA ou RNA. Os nanoporos são pequenos canais que, na natureza, formam passagens através das membranas biológicas. 

Na tecnologia de sequenciamento, os nanoporos de proteínas estão inseridos em uma membrana sintética e envolvidos por uma solução eletrofisiológica. Cada nanoporo corresponde a um eletrodo próprio conectado a um sensor, que mede a corrente elétrica que passa por ele.  

Conforme as bases da fita de DNA ou RNA passam pelo nanoporo, elas alteram a intensidade da corrente elétrica, e essa alteração é interpretada pelo detector, que registra a base lida.

 A Oxford Nanopore Technologies foi pioneira no sequenciamento direto de RNA (sem a necessidade de síntese de DNA complementar) e também permite a identificação de modificações de base, como a metilação.

Outro diferencial dessa tecnologia é que a análise dos dados do sequenciamento pode ser feita em tempo real, agilizando ainda mais os ensaios.

Sequenciamento por short reads x long reads

As metodologias de sequenciamento por short reads, utilizadas no sequenciamento de segunda geração, fragmentam o DNA de interesse em pequenos pedaços (em média, de 150 a 300 pares de base) durante a etapa de preparação da biblioteca de DNA. Posteriormente, esses pequenos pedaços são sequenciados e alinhados com um genoma de referência ou montadas de novo para gerar um genoma completo. 

Uma limitação dessa técnica é que ela sequencia fragmentos de no máximo 600 pares de base, sendo que a qualidade da detecção de fragmentos de acima de 200 pares de base cai drasticamente para muitas metodologias.

Além disso, a geração de fragmentos de DNA muito pequenos torna difícil a montagem de genomas complexos, regiões repetitivas e a identificação de certas variantes estruturais: inserções, deleções, duplicações, translocações e inversões. 

Imagine um grande quebra-cabeça em que a imagem é composta de muitos padrões repetitivos. Agora imagine que existem duas versões dele: uma com milhares de peças pequenas, e outra com algumas centenas de peças bem grandes. Qual dessas versões será mais fácil de montar?

Já a análise dos dados do sequenciamento pode ser feita em tempo real, agilizando ainda mais os ensaios.

Esse tipo de sequenciamento pode fornecer sequências contínuas e sem lacunas de regiões genômicas altamente repetitivas e complexas, o que permite uma montagem mais precisa do genoma. Além disso, o sequenciamento por long reads gera leituras de alta qualidade e permite a identificação de variantes genéticas raras e de baixa frequência com maior precisão em sequências repetitivas do genoma.

Nanopore: tamanho dos fragmentos A empresa já registrou leituras de sequências com mais de 4Mb de comprimento. Hoje a tecnologia já subdivide seus produtos em sequenciamento de sequências longas (long reads – até 100 Kb) e ultra longas (ultra-long reads – mais de 100 Kb).

Sequenciamento completo do genoma

A tecnologia de long reads foi utilizada no Consórcio Telomere-to-Telomere (telômero-a-telômero) que elucidou as regiões do DNA que ainda eram desconhecidas, permitindo o sequenciamento completo do genoma humano em 2020. 

O Projeto Genoma Humano (PGH) sequenciou cerca de 92% do genoma humano, mas não foi capaz de identificar com precisão regiões cromossômicas que possuem sequências muito repetitivas de bases nitrogenadas, como os telômeros, por causa de limitações técnicas das metodologias utilizadas. Assim, o Consórcio Telomere-to-Telomere foi uma iniciativa para realizar o sequenciamento de trechos imprecisos ou não cobertos pelo PGH.

Nanopore e o sequenciamento do novo coronavírus

No início da pandemia do novo coronavírus (SARS-CoV-2), pesquisadores brasileiros, como a biomédica Jaqueline Goes de Jesus, se destacaram na comunidade científica ao sequenciar o genoma do novo coronavírus presente no Brasil, em apenas 48 horas, utilizando a metodologia Nanopore (MinION).

Compreender as características genômicas do vírus e a possibilidade de identificar mutações e variantes emergentes rapidamente foi um fator-chave para o desenvolvimento de protocolos de testagem viral e para o desenvolvimento das vacinas contra o coronavírus.

Nanopore no diagnóstico de doenças causadas por regiões complexas

Um bom exemplo do uso do sequenciamento Nanopore na medicina atual é no diagnóstico da doença cística medular renal tipo 1 (do inglês, Medullary Cystic Kidney Disease Type 1- MCKD1).

A MCKD1 é uma doença tubulointersticial lentamente progressiva, resultando em falência renal e a necessidade de diálise ou transplante renal.

A doença possui padrão de herança autossômica dominante e é causada por variantes patogênicas no gene MUC1. O gene é responsável pela produção de uma proteína de superfície celular chamada mucina 1, que está envolvida em processos celulares como adesão celular, sinalização e proteção contra patógenos. 

As manifestações clínicas da doença ocorrem apenas no rim, onde a proteína alterada se acumula dentro das células renais, ocasionando morte de células tubulares e doença renal crônica progressiva.

Assim como diversas regiões do genoma, o gene MUC1 possui segmentos repetidos no DNA, chamadas repetições em tandem de número variável (do inglês variable number of tandem repeats– VNTRs). A VNTR do gene MUC1 é formada por repetições de uma sequência de 60 pares de base, que podem variar de 22 a 150 vezes dependendo da população.

Na maioria das variantes causadoras de doenças, ocorre uma mutação de mudança de quadro de leitura (ou Frameshift) no qual um nucleotídeo inserido ou deletado altera a leitura da sequência do DNA durante o processo de tradução, comprometendo a estrutura da proteína. No caso de MUC1, a maior parte das mutações de mudança de quadro de leitura ocorrem dentro do VNTR do gene.

Devido ao alto conteúdo de guanina-citosina do VNTR de MUC1 e sua natureza repetitiva, variantes dentro de um VNTR não podem ser identificadas por métodos de sequenciamento comumente usados, como sequenciamento de nova geração por short reads ou sequenciamento de Sanger. 

O sequenciamento por Nanopore é capaz de identificar as VNTRs do gene MUC1 e atingir uma taxa diagnóstica mais alta do que por NGS, que não consegue sequenciar toda a região de interesse em uma única sequência. Por isso, Nanopore é uma metodologia indicada para o diagnóstico de MCKD1. 

Na Mendelics o diagnóstico da doença cística medular renal tipo 1 é feito por Nanopore, para a identificação das variantes resultantes de alterações no VNTR do gene MUC1, e em outras regiões do gene, atingindo uma alta taxa diagnóstica para a doença.

Painel Completo de Doenças Renais

A Mendelics está constantemente buscando evoluir e revolucionar o diagnóstico genético, por isso, tornou a análise de variantes germinativas associadas às doenças renais mais robusta (short reads e long reads). 

Lançamos o Painel Completo de Doenças Renais que analisa 547 genes associados às doenças renais + CNVs (variação no número de cópias) por Sequenciamento de Nova Geração e análise de MUC1 por Nanopore, promovendo o diagnóstico de 390 doenças renais hereditárias.

Entre em contato conosco e saiba mais sobre os painéis genéticos para nefrologistas e outras especialidades. 

Revisão

Como funciona o sequenciamento pela metodologia Nanopore?O sequenciamento Nanopore é um método de sequenciamento de nova geração que utiliza nanoporos para identificar diretamente as bases do DNA ou RNA.  Quais as vantagens do sequenciamento por long reads? O sequenciamento por long reads permite a análise de regiões genômicas altamente repetitivas e complexas, o que permite uma montagem mais precisa do genoma. Além disso, o sequenciamento por long reads gera leituras de alta qualidade e permite a identificação de certas variantes estruturais com maior precisão em sequências repetitivas do genoma.

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Referências

• Amarasinghe SL, Su S, Dong X, Zappia L, Ritchie ME, Gouil Q. Opportunities and challenges in long-read sequencing data analysis. Genome Biol. 2020.
• Deamer D, Akeson M, Branton D. Three decades of nanopore sequencing. Nat Biotechnol. 2016.
• Bleyer AJ, Živná M, Kidd K, et al. Doença Renal Tubulointersticial Autossômica Dominante – MUC1. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): Universidade de Washington, Seattle; 1993-2023
• Park J, Bakhtiari M, Popp B, Wiesener M, Bafna V. Detecting tandem repeat variants in coding regions using code-adVNTR. iScience. 2022.