Entenda as técnicas de NGS Targeted Sequencing

Entenda as técnicas de NGS Targeted Sequencing

O que é NGS targeted sequencing


As técnicas de sequenciamento de nova geração (do inglês Next Generation Sequencing, NGS) desenvolvidas nas últimas décadas permitiram o sequenciamento de genomas completos de vários indivíduos simultaneamente, diminuindo de maneira significativa o custo e tempo das análises. A tecnologia de target sequencing (sequenciamento alvo), permite selecionar regiões específicas do genoma (regiões alvo, geralmente genes específicos,  que vão compor uma biblioteca), tornando as análises ainda mais rápidas e menos custosas.

Quanto a estratégia utilizada para seleção das regiões de interesse (sequências alvo), o NGS por ser dividido em dois tipos: Sequenciamento baseado em Amplicons (Amplicon-based Sequencing – sequenciamento por amplificação em emulsão) e Sequenciamento por Hibridização e Captura (Hybridization-based Capture Sequencing).

Entenda mais sobre NGS nesse artigo.

Sequenciamento por Amplificação

Nessa técnica, as regiões do DNA que serão analisadas são selecionadas utilizando primers específicos. Esses primers são pequenas sequências de bases que se complementam com as regiões de interesse no DNA. Os fragmentos selecionados são, então, amplificados por PCR para aumentar o número de cópias na biblioteca e facilitar a detecção. Chamamos essas cópias de amplicons.

Os primers utilizados, além de selecionar as regiões do DNA que serão analisadas, também adicionam adaptadores nas extremidades dos amplicons. Esses adaptadores contém os índices (sequência curta de bases que identificam cada amostra), e sequências complementares aos primers da flowcell (placa onde ocorre o sequenciamento), utilizados no sequenciamento (Figura 1).

 

Figura 1: A técnica de Sequenciamento por Amplificação resulta em uma cobertura pouco uniforme e perdas de variantes por dropout.

 

Apesar de ser uma técnica mais simples e barata existem algumas desvantagens:

  1. Cada região de interesse necessita de um par de primers específico, o que limita a quantidade de regiões que podem ser analisadas simultaneamente por esse tipo de técnica (1,2).
  2. A ligação do primer à fita de DNA ocorre em uma temperatura específica que pode variar para cada par de primers. Por isso, alguns amplicons vão ser multiplicados com mais facilidade e eficiência que outros, resultando em coberturas (número de vezes que uma região é representada) desiguais das diferentes regiões de interesse (1,2).
  3. Os primers precisam ser complementares à fita de DNA onde vão se ligar. A presença de variações (mutações) pode impedir a amplificação (exclusão alélica, ou dropout, em inglês). Eventos dropout podem resultar tanto na perda da cobertura, quando nem a cópia materna nem a paterna são amplificadas, quanto na genotipagem equivocada de homozigotos (indivíduos com duas cópias iguais de um ponto de variação), quando somente uma cópia é sequenciada, diminuindo a acurácia da técnica (1,2).

 

Sequenciamento por Hibridização e Captura

Nessa técnica o DNA é fragmentado em pedaços menores que se sobrepõem. Os fragmentos contendo as regiões de interesse são ligados aos adaptadores que possuem os índices de identificação das amostras e as sequências complementares aos primers da flowcell. Esses fragmentos são, então, hibridizados (ligados) a sondas que possuem uma molécula de biotina aderida à elas, e é utilizada para capturar os fragmentos de interesse.

O Sequenciamento por Hibridização e Captura não faz uso de amplicons (Figura 2) para enriquecer a biblioteca com as regiões de interesse, dessa forma, os problemas encontrados nas análises de Sequenciamento por Amplificação são sanados.

  1. O Sequenciamento por Hibridização e Captura consegue capturar todas as regiões de interesse (não ocorre exclusão alélica), apresentando maior sensibilidade e acurácia (1,2).
  2. Apresenta cobertura mais homogênea dos fragmentos sequenciados, além de possibilitar o sequenciamento de uma quantidade virtualmente infinita de regiões de interesse (1,2,3)

 

ngs targeted sequencing sequenciamento por hibridização

Figura 2: A Técnica de Sequenciamento por Hibridização e Captura leva à uma cobertura mais homogênea das regiões de interesse.

 

Assim, apesar da técnica de Sequenciamento por Hibridização e Captura ser mais complexa e poder apresentar custo mais elevado, ela permite uma análise mais sensível e acurada dos genes de interesse. Por isso, a Mendelics utiliza kits de preparo de bibliotecas de Sequenciamento por Hibridização e Captura para as análises e diagnóstico genético.

 


Referências

  1. G. Matthijs et al., “Guidelines for diagnostic next-generation sequencing”, European Journal of Human Genetics, vol. 24, no. 1, pp. 2–5, Oct. 2015, doi: 10.1038/ejhg.2015.226.
  2. E. Samorodnitsky et al., “Evaluation of hybridization capture versus Amplicon‐Based methods for Whole‐Exome sequencing”, Human Mutation, vol. 36, no. 9, pp. 903–914, Jul. 2015, doi: 10.1002/humu.22825.
  3. S. S. Hung et al., “Assessment of capture and amplicon-based approaches for the development of a targeted next-generation sequencing pipeline to personalize lymphoma management,” The Journal of Molecular Diagnostics, vol. 20, no. 2, pp. 203–214, Mar. 2018, doi: 10.1016/j.jmoldx.2017.11.010.
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