Tecnologias para diagnóstico genético

Tecnologias para diagnóstico genético

Diagnóstico genético: diferentes tecnologias para diferentes aplicações

Existem várias tecnologias de análise genética que podem ser aplicadas para o diagnóstico de doenças. Cada tecnologia é capaz de identificar diferentes tipos de alterações genéticas e, por isso, tem uma aplicação específica.

 

Sequenciamento de Nova Geração (NGS)

Essa tecnologia permite analisar bilhões de regiões do DNA simultaneamente. Por isso, o NGS é utilizado no Sequenciamento Completo do Exoma, em que todos os mais de 20.000 genes do nosso genoma são sequenciados, e nos painéis, que analisam conjuntos específicos de genes relacionados a algum tipo de doença.

O Exoma é um exame bastante completo, indicado inclusive para casos de paciente com sinais e sintomas de origem desconhecida. Já os painéis funcionam muito bem quando existe uma suspeita médica de algum tipo de doença específica: por exemplo, se há uma suspeita de Distúrbios do Neurodesenvolvimento, o painel do Programa Movimente pode ser ideal.

Por ser muito versátil, o NGS também pode ser utilizado em exames customizados. Caso haja a necessidade de analisar algum gene específico que não está incluso em nenhum dos painéis, é possível solicitar o sequenciamento customizado dessa região.

Com o NGS conseguimos avaliar diferentes tipos de alterações genéticas, como SNPs, inserções e deleções de poucas bases até grandes trechos, como CNVs, além de permitir análise de DNA mitocondrial.

Ilustração do fluxo NGS, desde o preparo da amostra à emissão do laudo.

 

SNP-Array (Hibridização Genômica em Microarray)

A tecnologia empregada no SNP-Array permite analisar até milhões de variantes genéticas específicas, conhecidas por causar doenças genéticas e alterar a metabolização de fármacos. Com um SNP-Array de alta densidade também é possível identificar grandes perdas e ganhos cromossômicos, como os causados por CNVs, ou até aqueles envolvendo cromossomos inteiros.

O SNP-Array pode ser indicado para o diagnóstico de condições causadas por CNVs, como Malformações Congênitas, Deficiência Intelectual (DI), Atraso de Desenvolvimento Neuropsicomotor, Transtorno do Espectro Autista (TEA), Dificuldades de aprendizado e Restrição de Crescimento, ou causadas por aneuploidias, como a Síndrome de Down (trissomia do cromossomo 21) e a Síndrome de Turner (monossomia do cromossomo X em pessoas do sexo feminino).

O exame também é recomendado para a investigação de quadros clínicos de causa desconhecida.

Ilustração do fluxo de Array, desde o preparo da amostra à emissão do laudo

 

MLPA

O MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) é uma técnica desenvolvida para a identificação de CNVs e análise de metilação em regiões específicas do genoma. Por isso, essa técnica é indicada sempre que há suspeita de alguma doença genética causada por esses tipos de alteração.

Exames de MLPA podem ser indicados para diagnóstico de diversas condições, desde doenças raras como a Síndrome do X-Frágil, até cânceres hereditários.

Doenças causadas por alterações nos padrões de metilação do DNA, como as Síndromes de Angelman e Prader-Willi, também podem ser diagnosticadas por MLPA.

O que é metilação?

A metilação é uma alteração química que ocorre nas bases que compõem o DNA.

Os padrões de metilação são muito importantes para a expressão gênica e o funcionamento do nosso organismo, pois eles determinam quais genes devem ser expressos e quais devem ser silenciados.

 

Ilustração do fluxo do MLPA, desde o preparo da amostra à emissão do laudo

 

Sequenciamento Sanger

O sequenciamento Sanger é uma das tecnologias mais antigas de sequenciamento e têm uma grande relevância até hoje. Essa tecnologia é capaz de sequenciar fragmentos maiores, permitindo a análise de regiões complexas.

Por isso, essa tecnologia é a mais indicada para o diagnóstico de doenças causadas por mutações em genes complexos, como a Hiperplasia Adrenal Congênita, causada por alterações no gene CYP21A2.

Esse tipo de exame também é indicado para a confirmação de diagnóstico, onde somente uma região do genoma precisa ser avaliada, como ocorre na investigação de variantes patogênicas em pais e mães de crianças diagnosticadas com alguma doença genética. 

Ilustração do fluxo de sequenciamento Sanger, desde o preparo da amostra à emissão do laudo

 

Diagnóstico genético na Mendelics

A Mendelics é pioneira em diagnóstico genético por NGS na América Latina. Já realizamos mais de 100.000 análises genéticas, contribuindo com o diagnóstico de milhares de brasileiros e latino americanos. 

Oferecemos o Exoma mais completo do mercado, com análise de CNVs e DNA mitocondrial (quando necessário) já inclusos no mesmo exame. Também temos um extenso portfólio de painéis de NGS, exames por SNP-Array, MLPA (convencional e metilação) e Sequenciamento Sanger que atendem diversas especialidades médicas.

Somos o único laboratório de análises genéticas da América Latina a obter as três principais acreditações da área: 

  • Acreditação do CAP: reconhecida como a mais importante para laboratórios clínicos. O CAP (College of American Pathologists), é a principal organização de patologistas certificados em todo o mundo, garantindo aos pacientes serviços de alta qualidade. A Mendelics está acreditada desde 2017 sob o número 8671464.
  • Norma do ISO 15189:2015: certifica a competência do Sistema de Gestão da Qualidade da empresa e determina requisitos gerais para que o laboratório tenha competências reconhecidas para realizar suas atividades demonstrando o compromisso com a qualidade e com a competência técnica. A Mendelics é acreditada pela Coordenação Geral de Acreditação do Inmetro (Cgcre) desde 2018 sob o número CLC 0007.
  • Acreditação PALC: programa de Acreditação de Laboratórios Clínicos da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial (SBPC/ML), que possui foco nas boas práticas laboratoriais, proporcionando um gerenciamento efetivo destes processos, aumento da segurança, e fornecimento de resultados mais confiáveis. A Mendelics está acreditada pelo PALC desde 2020 sob o número 32290508.

 

Quer saber mais sobre as técnicas laboratoriais empregadas na Mendelics?

Deixe sua pergunta nos comentários abaixo ou entre em contato com a nossa equipe pelo telefone (11) 5096-6001 ou através do nosso site.

Sequenciamento Sanger: vantagens para a medicina contemporânea

Sequenciamento Sanger: vantagens para a medicina contemporânea

Entenda mais sobre a técnica de sequenciamento Sanger, que possibilitou o sequenciamento do primeiro genoma humano e como ela ainda é importante 20 anos depois.

 

História do Sequenciamento Sanger

A tecnologia de sequenciamento Sanger surgiu na década de 70 e foi o primeiro grande passo para o sequenciamento massivo de DNA, sendo conhecida hoje como sequenciamento de primeira geração. Essa foi a tecnologia que permitiu o lançamento do Projeto Genoma Humano em 1991, que prometia sequenciar o primeiro genoma humano nos 15 anos seguintes.

Em 2001, o Projeto Genoma Humano publicava o rascunho do primeiro genoma humano, 4 anos antes do previsto, graças ao Sanger e ao desenvolvimento de técnicas de sequenciamento massivo em paralelo, também conhecido como Sequenciamento de Nova Geração (NGS), que teve início na década de 1990.

 

Sequenciamento Sanger x Sequenciamento de Nova Geração

A tecnologia NGS é hoje a principal ferramenta utilizada para sequenciamento na área diagnóstica. Com ela é possível sequenciar várias regiões do DNA, e várias amostras, ao mesmo tempo, reduzindo muito o custo da análise por amostra. No entanto, esse tipo de ensaio tem suas limitações, que podem, em muitos casos, ser sanadas pela tecnologia Sanger.

Na imagem abaixo é possível ver que, com NGS, o DNA é quebrado em pequenos fragmentos, que são sequenciados e depois realinhados através de ferramentas de bioinformática, como um grande quebra-cabeças. Isso dificulta analisar regiões homólogas (semelhantes) e repetitivas do DNA por NGS, pois não sabemos onde encaixar esses fragmentos.

Ilustração comparando a análise de regiões homólogas (semelhantes) por sequenciamento de nova geração (NGS) e por sequenciamento Sanger

Figura 1. Comparação entre análises de regiões homólogas por Sequenciamento de Nova Geração (NGS) e por Sequenciamento Sanger.

Esse problema pode ser resolvido sequenciando fragmentos mais longos, que compreendam as regiões flanqueadoras (regiões que cercam esses trechos). Com peças maiores, é mais fácil resolver o quebra-cabeça.

Enquanto o NGS analisa fragmentos de até 300 pares de bases (pb), o sequenciamento Sanger permite analisar fragmentos que chegam a cerca de 800pb, sendo mais indicado para a análise de regiões complexas.

O sequenciamento tipo Sanger utiliza alguns nucleotídeos modificados com fluoróforos (moléculas que emitem luminescência), e resulta em cópias com diferentes tamanhos da sequência do DNA de interesse, mas que se iniciam na mesma posição, como mostrado na figura abaixo.

Os fragmentos são separados por tamanho e as bases finais de cada cópia são identificadas pela fluorescência.

Ilustração de como é feito o sequenciamento sanger, onde os nucleotídeos alterados com fluoróforos identificam a inserção de cada base que compõe a sequência

Figura 2. Sequenciamento Sanger. Os fragmentos sequenciados são identificados por tamanho e pela fluorescência emitida pela última case adicionada. Dessa forma é possível determinar a sequência de nucleotídeos da região de interesse.

 

Dessa forma, o sequenciamento Sanger permite identificar variantes genéticas em sequências mais longas de DNA, sem a necessidade de uma etapa computacional de reconstrução dos trechos sequenciados.

 

Sanger no diagnóstico de doenças causadas por regiões complexas

Um bom exemplo do uso do sequenciamento Sanger na medicina atual é no diagnóstico da Hiperplasia Adrenal Congênita (CAH) resultante da deficiência da enzima 21-hidroxilase.

Essa doença leva à produção excessiva de hormônios andrógenos (masculinos), podendo causar o desenvolvimento de genitália ambígua em pessoas do sexo feminino, além de puberdade precoce em ambos os sexos.

Cerca de 75% dos casos também apresenta deficiência do hormônio aldosterona, que leva à dificuldade de reter água e sais, causando desidratação, baixo volume de sangue circulante (hipovolemia) e pressão baixa (hipotensão).

A CAH com deficiência de 21-hidrogenase é causada por alterações no gene CYP21A2, que possui um pseudogene homólogo, o CYP21A1P. Esse pseudogene é uma região do DNA muito semelhante ao gene CYP21A2, porém não é funcional, ou seja, a partir dele não é possível produzir a enzima 21-hidroxilase.

Durante a formação dos gametas ocorrem alguns eventos de recombinação do DNA, nos quais os pares de cromossomos se recombinam resultando em sequências híbridas daquelas que herdamos dos nossos pais. Durante esse processo, regiões homólogas (CYP21A2 e CYP21A1P, por exemplo) podem ser indevidamente pareadas e, consequentemente, trocadas durante a recombinação.

Como mostrado na figura abaixo, tanto a troca de regiões entre o gene CYP21A2 e o pseudogene CYP21A1P, quanto a união deles (resultado de uma deleção) podem comprometer a produção da 21-hidrogenase. Cerca de 95% das alterações genéticas que levam à CAH são resultantes de recombinações entre as regiões homólogas.

Ilustração dos eventos de recombinação e deleção na região do gene CYP21A2 e do pseudogene CYP21A1P que resultam em Hiperplasia Adrenal Congênita (CAH) com deficiência da enzima 21-hidroxilase.

Figura 3. Ilustração dos eventos de recombinação e deleção na região do gene CYP21A2 e do pseudogene CYP21A1P que resultam em Hiperplasia Adrenal Congênita (CAH) com deficiência da enzima 21-hidroxilase.

O sequenciamento de Sanger é capaz de identificar essas recombinações e atingir uma taxa diagnóstica mais alta que os painéis de NGS, que não conseguem sequenciar toda a região de interesse em uma única sequência. Por isso, Sanger é a metodologia mais indicada para o diagnóstico de CAH com deficiência de 21-hidrogenase.

Na Mendelics o diagnóstico da Hiperplasia Adrenal Congênita resultante da deficiência da enzima 21-hidroxilase é feito por Sanger e MLPA, para a identificação das variantes resultantes de recombinações e das deleções, respectivamente, atingindo uma alta taxa diagnóstica para a doença.

Conheça o exame

 

Consulte sempre seu médico e, se precisar de um exame diagnóstico, entre em contato com a nossa equipe.


Referências

Khan Academy – Sequenciamento de DNA

National Human Genome Research Institute (NHGRI) – DNA Sequencing Costs: Data

National Organization for Rare Disorders – Congenital Adrenal Hyperplasia

Nimkarn S, et al. 21-Hydroxylase-Deficient Congenital Adrenal Hyperplasia. 2002. In: Adam MP, et al., editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2021.

Pignatelli D., et al. The complexities in genotyping of congenital adrenal hyperplasia: 21-Hydroxylase deficiency. 2019. Frontiers in Endocrinology, vol. 10.

Glossário de genética II

Glossário de genética II

Entenda termos importantes em genética e genômica no nosso segundo glossário de genética

Conheça as edições I e III do glossário.

 

Genética

Genética é o estudo dos genes e como eles são herdados.

Os termos genética e genômica são frequentemente usados de forma intercambiável. A genética é o estudo dos genes, enquanto a genômica é o estudo de todo o DNA necessário para construir um organismo, incluindo os genes. 

 

Genômica 

É o estudo dos genomas de humanos e todos os organismos vivos.

Este termo também é usado quando se fala de técnicas relacionadas ao laboratório de biologia molecular e à bioinformática. 

O estudo da genômica em humanos concentra-se em áreas do genoma associadas à saúde e à doença. A genômica está impactando a medicina em vários aspectos, incluindo a predição de risco, prevenção, diagnóstico, manejo, prognóstico e até o tratamento de doenças raras, câncer, doenças infecciosas, entre outras. Além disso, também é essencial para o desenvolvimento de novas terapias direcionadas, como no caso do tratamento da Fibrose Cística e da Atrofia Muscular Espinhal. 

 

Bioinformática

É a aplicação da ciência da computação e tecnologia da informação para solucionar problemas biológicos, por exemplo, algoritmos (conjunto de instruções e regras) de análise de dados genômicos, e gerenciamento e armazenamento de dados.

A interpretação dos dados é uma parte importante do processo de análise genômica, desde a coleta de uma amostra do paciente até a entrega dos resultados. A bioinformática é crucial para a interpretação desses dados.

Conheça o Abracadabra, o software de análise de dados genômicos da Mendelics.

 

Sequenciamento

Técnica utilizada em laboratórios para determinar a ordem exata dos pares de bases do DNA em uma ou múltiplas regiões de interesse, ou até mesmo no genoma completo.

O sequenciamento refere-se a todos os métodos de sequenciamento, incluindo o Sanger e o Sequenciamento de Nova Geração (NGS). O método usado dependerá do contexto clínico – às vezes pode ser necessário sequenciar todo o genoma de um indivíduo, enquanto em outros momentos, uma pequena região ou apenas um gene é suficiente.

 

Sequenciamento Sanger

O sequenciamento de Sanger foi uma revolução nas tecnologias de sequenciamento quando foi descrito, por Frederick Sanger, em 1977 e foi usado no Projeto Genoma Humano para sequenciar pela primeira vez o genoma humano completo.

O método de Sanger é considerado uma tecnologia de “primeira geração”, e é mais utilizada no sequenciamento de fragmentos de DNA de até 1000 pares de bases.

Embora os métodos da nova geração sejam mais baratos e rápidos, o sequenciamento Sanger ainda é usado em algumas situações, como para confirmar a presença de algumas mutações já conhecidas.

 

Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing, NGS)

É o termo usado para descrever as técnicas modernas de sequenciamento de DNA de alto rendimento que surgiram depois do sequenciamento Sanger. Também pode ser chamado de Sequenciamento Massivo em Paralelo (Massively parallel sequencing) ou Sequenciamento de Próxima Geração.

O sequenciamento Sanger foi um grande avanço na tecnologia de sequenciamento, porém o NGS permite resultados precisos de maneira mais rápida e muito mais econômica.

Enquanto o Sanger sequencia os fragmentos de DNA individualmente, o NGS é uma técnica de sequenciamento em larga escala, no qual milhões e até bilhões de fragmentos são sequenciados simultaneamente em uma única corrida

O NGS também possibilita sequenciar centenas de amostras em uma única corrida. As inovações técnicas do NGS também permitiram reduzir os custos do sequenciamento, que vêm decrescendo significativamente nos últimos 18 anos. 

 

Sequenciamento do genoma completo (Whole Genome Sequencing, WGS)

É o sequenciamento de quase todo o genoma, incluindo éxons, íntrons e regiões intergênicas. Pode incluir o genoma mitocondrial ou não.

Por sequenciar todo o DNA, o WGS é mais caro e requer mais capacidade de processamento e armazenamento dos dados gerados. Por isso, é mais utilizado no contexto de pesquisas científicas, no estudo de genomas populacionais ou na busca de alterações que causam doenças ainda sem causa elucidada, por exemplo.

 

Sequenciamento do exoma completo (SCE ou Whole Exome Sequencing, WES)

É o sequenciamento de todos os éxons (regiões codificantes dos genes) do genoma, e que representa cerca de 2% deste. O conjunto de todos os éxons do genoma é chamado de exoma, por isso, o SCE é popularmente chamado de ‘exoma‘.

O SCE é uma ferramenta poderosa para diagnosticar milhares de doenças genéticas. É indicado para pacientes com doença genética já suspeitada clinicamente (exemplo: síndromes genéticas específicas, beta-talassemia), para pacientes com quadros clínicos de causa desconhecida e que podem ter origem genética (exemplo: deficiência intelectual) e também pode ser solicitado quando há suspeita de doença que pode ser causada por um entre muitos genes diferentes e para a qual não exista outro exame genético mais apropriado.

 

Sequenciamento de painel de genes

Um exame genético que utiliza o NGS para sequenciar um grupo de genes associados ao desenvolvimento de uma condição/doença ou à uma coleção de sintomas clínicos sob investigação. Por exemplo, o Painel de doenças tratáveis ou Painel de Epilepsias.

Identificar uma variante responsável pela doença/condição pode ser um processo extremamente demorado. O painel de genes pode ser útil para focar a análise genética naqueles genes que já estão associados à condição suspeita ou às manifestações apresentadas pelo paciente, reduzindo o tempo e vieses nas análises.

O tamanho do painel pode variar, de poucos genes a mais de uma centena.

 


Quer entender mais sobre termos importantes na genética e genômica, leia também a primeira parte do nosso glossário aqui.