O Genoma Brasileiro

O Genoma Brasileiro

Como o genoma brasileiro contribui com a medicina mundial

Quando olhamos para as diferentes populações ao redor do mundo, fica fácil ver como os seres humanos são diversos. Em cada região temos uma população com características próprias e muito diversas.

São infinitos tons de pele, olhos e cabelos. Diferenças no formato dos olhos, do rosto, da textura dos fios do cabelo e tantos outros traços físicos visíveis. Mas, a diversidade humana não está só nas características físicas.

Diferentes populações apresentam diferentes predisposições e prevalência para várias doenças, e isso se deve, em boa parte, às diferenças nos seus genomas.

 

Porque as populações são geneticamente diversas?

Essas diferenças surgiram porque as populações se desenvolveram em diferentes partes do planeta, e precisaram se adaptar a ambientes diferentes, e se mantiveram por conta de barreiras geográficas ou culturais que impediam que se misturassem ao longo do tempo.

Porém, alguns países passaram por vários eventos migratórios que resultaram na miscigenação de povos diferentes. O Brasil foi um desses países. (1,2)

No Brasil, os colonizadores portugueses se relacionaram com os habitantes nativos americanos e, posteriormente, com escravos trazidos do continente africano. Além disso, houveram outros eventos migratórios importantes de italianos, holandeses, alemães, povos do oriente médio e leste asiático, como Japão e China, dentre outros. (1,2)

Assim, a população brasileira possui uma composição genética única, híbrida de vários povos diferentes.

 

Diversidade genética nos Bancos de Dados

Populações miscigenadas podem apresentar variantes genéticas que são pouco frequentes ou inexistentes no restante do mundo e, por isso, não vão estar representadas nos bancos de dados de outras populações.

Se essas variantes forem patogênicas (causarem doenças), esses bancos de dados não serão capazes de avaliar de maneira eficiente o efeito delas na nossa saúde.

Além disso, variantes raras associadas com doenças em outros lugares do mundo, podem ser mais comuns em populações miscigenadas e, portanto, não estão relacionadas com o desenvolvimento de doenças raras nessas populações.

Está clara a importância de realizar testes de diagnóstico genético utilizando um banco de dados que represente o genoma da população brasileira. Um genoma como o seu!

Infelizmente, a maior parte dos estudos sobre doenças genéticas são feitos utilizando bancos de dados de indivíduos europeus, ou de descendência europeia. Somente cerca de 20% dos indivíduos reportados em estudos de associação genética inseridos no Catálogo GWAS (Genome Wide Association Studies) são não-europeus. (3)

A Mendelics é o primeiro laboratório brasileiro dedicado à análise genômica e já analisou mais de 100 mil amostras, sendo mais de 60 mil exomas completos, formando o maior banco de dados genômicos da América Latina!

 

A importância do genoma brasileiro/latino americano

Não há dúvidas de que a população brasileira é diversa. Mas quanto? Vamos tentar colocar em números:

  • O projeto internacional HGDP (Human Genome Diversity Project), que investiga a variabilidade genética do ser humano, encontrou cerca de 73 milhões de variantes genéticas em um total de 54 populações espalhadas pelo mundo todo. (4)
  • Estudos nacionais sobre a variabilidade genética somente da população brasileira, encontraram mais de 61 milhões de variantes. (5)

Temos, só no Brasil, quase a mesma variabilidade encontrada no mundo todo. O nosso genoma é muito diverso! 

Esses estudos também mostraram que mais de 2 milhões das variantes genéticas encontradas no genoma brasileiro são inéditas. Ou seja, mais de 2 milhões das variantes brasileiras nunca haviam sido reportadas antes, em nenhum outro lugar do mundo. (5)

Considerando que o genoma brasileiro é muito diverso, ele contribui muito com a caracterização da variabilidade genética humana e com estudos de doenças genéticas que podem afetar pessoas no mundo todo. O estudo do genoma brasileiro pode trazer ganhos para a medicina mundial.

A fim de contribuir com a comunidade médica, a Mendelics já fez mais de 9 mil depósitos no Clinvar (banco de dados que reúne informações sobre alterações genéticas que causam doenças) (6), e é a segunda maior contribuinte do repositório fora dos Estados Unidos.

Também contribuímos com o estudo da variabilidade genética humana alimentando o maior banco de dados genômicos da América Latina!

Quer entender melhor como o Banco de Dados Mendelics pode auxiliar no diagnóstico de doenças raras no Brasil e na América Latina?

Assista essa aula ministrada por médicos geneticistas da Mendelics, onde são apresentados casos reais em que o nosso banco de dados foi crucial para o diagnóstico: Aula banco de dados genéticos – Mendelics

Conheça mais sobre as origens do povo brasileiro e como descobrir de onde vieram seus ancestrais nesse post!

 


Referências

  1. S. D. J. Pena, F. R. Santos, and E. Tarazona‐Santos, “Genetic admixture in Brazil,” American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics, vol. 184, no. 4, pp. 928–938, Nov. 2020, doi: 10.1002/ajmg.c.31853.
  2. R. B. Andrade et al., “Estimating Asian Contribution to the Brazilian Population: A New Application of a Validated Set of 61 Ancestry Informative Markers”, G3, vol. 8, no. 11, pp. 3577–3582, Nov. 2018, doi: 10.1534/g3.118.200650.
  3. G. Sirugo, S. M. Williams, and S. A. Tishkoff, “The Missing Diversity in Human Genetic Studies,” Cell, vol. 177, no. 1, pp. 26–31, Mar. 2019, doi: 10.1016/j.cell.2019.02.048.
  4. A. Bergström et al., “Insights into human genetic variation and population history from 929 spanerse genomes,” Science, vol. 367, no. 6484, p. eaay5012, Mar. 2020, doi: 10.1126/science.aay5012.
  5. M. S. Naslavsky et al., “Whole-genome sequencing of 1,171 elderly admixed inspaniduals from the largest Latin American metropolis (São Paulo, Brazil)”, Set. 2020, doi: 10.1101/2020.09.15.298026.
  6. ClinVar, “Mendelics – Submitter – ClinVar”. Acesso em 30 de abril de 2021. Disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/submitters/500035/
CRISPR/Cas9: edição do DNA e o tratamento de doenças

CRISPR/Cas9: edição do DNA e o tratamento de doenças

CRISPR/Cas9: Prêmio Nobel de Química 2020


Em outubro de 2020, o mundo conheceu os vencedores do prêmio Nobel de química de 2020: duas cientistas, Dra. Jennifer Doudna e Dra. Emmanuelle Charpentier, foram laureadas pelo desenvolvimento de uma técnica de edição de genes chamada CRISPR/Cas9 (1). 

Em um artigo publicado na revista Science (2), em 2012, elas demonstraram que o CRISPR/Cas9, um mecanismo presente no sistema imunológico de bactérias – poderia  ser utilizado para editar o DNA humano in vitro.

Logo após essa publicação, laboratórios (e indústrias) no mundo todo passaram a explorar essa técnica em suas pesquisas, com diferentes aplicações.

O campo para uso do CRISPR/Cas9 é vasto, tanto para humanos quanto para animais e plantas. Muitas indústrias agrícolas estão desenvolvendo sistemas de controle de pragas, ou melhoramento de plantas (3).

Muito tem sido falado sobre essa técnica em todo o mundo. O CRISPR/Cas9, de fato, revolucionou a pesquisa científica na medicina e a genômica por ser um método de manipulação genética simples, versátil e preciso. 

Mais do que uma ferramenta de pesquisa, o CRISPR/Cas9 é uma esperança para muitas doenças genéticas finalmente terem um tratamento.

Mas o que é o CRISPR/Cas9 e por que se fala tanto dessa técnica? Nesse artigo, entenda essa técnica e saiba como ela pode ajudar no tratamento de doenças genéticas.

 

O CRISPR/Cas9

O CRISPR/Cas9 (sigla para Conjunto de Repetições Palindrômicas Regularmente Espaçadas em associação com a nuclease Cas9) é, hoje, o nome de uma técnica de biologia molecular capaz de editar (remover, adicionar, trocar) sequências de DNA localizadas em qualquer região do genoma. Essa técnica é baseada em um sistema de memória imunológica presente nas bactérias, usado para proteger as bactérias de invasões de vírus (2,3,4).

O sistema CRISPR/Cas9 consiste em duas moléculas:

  • Cas9: uma enzima (nuclease) que atua como um par de “tesouras” que pode cortar as duas fitas do DNA em um local específico no genoma.
  • RNA guia (gRNA): um pequeno pedaço de sequência de RNA (com cerca de 20 bases de comprimento) localizada dentro de uma estrutura de RNA mais longa. Essa molécula de RNA “guia” a Cas9 para a parte do genoma que deverá ser cortada.

E como o sistema atua?

Conhecendo previamente uma sequência no DNA que se quer alterar (como, por exemplo, uma mutação que causa uma doença), o gRNA é ‘fabricado’ para se ligar (ser complementar) a essa região específica. O gRNA leva a Cas9 até essa sequência complementar que corta essa região. Logo, o sistema de reparo de DNA, que é natural e intrínseco, ‘conserta’ a região que foi cortada acrescentando a(s) base(s) que foi removida (2,3,4).

Utilizando o sistema CRISPR/Cas9 é possível induzir o sistema de reparo do DNA a reparar o DNA alterado com uma sequência de interesse. Dessa forma, o sistema é capaz de reparar, silenciar e reprimir genes, entre outras alterações genômicas.

 

Edição do DNA e o tratamento de doenças

O CRISPR/Cas9 tem um enorme potencial para ser usado como ferramenta no tratamento de diversas doenças que possuem causa genética,  como câncer e doenças monogênicas, e  doenças infecciosas, como hepatite B e o HIV, por exemplo.

 

Câncer

O câncer é causado pelo acúmulo de alterações genéticas que levam a multiplicação desordenada das células formando um tumor. Existem vários fatores genéticos já identificados relacionados com a predisposição a desenvolver um tumor, com o local do crescimento do tumor, o seu tamanho e sua malignidade.

Estudos têm o aplicado sistema CRISPR/Cas9 para editar ou remover mutações em genes (oncogenes e proto-oncogenes) que causam essa proliferação celular descontrolada e podem resultar eventualmente em um câncer (5).

Outros estudos têm utilizado o sistema para entender fatores que desencadeiam o crescimento do tumor (tumorigênese) e sua malignidade para selecionar genes alvo para tratamento do câncer a partir de terapia gênica (5).

Além da terapia gênica focada nas alterações que promovem o câncer, resultados promissores foram vistos em estudos clínicos que utilizaram o CRISPR/Cas9 para imunoterapia de pacientes com câncer. Esses estudos retiraram células imunológicas do paciente com câncer (células T ou CAR-T), alteram essas células in vitro utilizando o  CRISPR/Cas9 e depois as reintroduziram no organismo do paciente. Os resultados foram positivos, mostrando que as células do sistema imune do paciente conseguiram rejeitar os tumores (6, 7).

 

Doenças infecciosas

O sistema CRISPR/Cas9 foi originalmente descoberto como um mecanismo de defesa de bactérias contra a invasão de vírus. Logo, é uma ferramenta que naturalmente demonstra ser promissora no tratamento de doenças infecciosas (2).

Vários estudos em células-tronco demonstram o potencial protetor do gene CCR5 contra o vírus HIV. Alterações nesse gene conferem resistência à infecção pelo vírus (8, 9).

Em 2018, uma notícia percorreu todas as mídias: um cientista chinês anunciou que duas bebês gêmeas nasceram após os embriões serem geneticamente modificados através da técnica de CRISPR/Cas9. Os embriões tiveram seu DNA editado, mais precisamente o gene CCR5, para que fossem resistentes ao vírus HIV. O cientista relatou que os bebês nasceram saudáveis e sem nenhuma sequela. Porém, a edição genética de embriões é um assunto controverso. O anúncio gerou diversas discussões mundiais e o cientista foi condenado (10).

Além da alteração de genes que conferem resistência ao vírus, o CRISPR/Cas9 se mostrou muito eficaz em um estudo que combinou a técnica de edição de genes com uma terapia anti-retroviral (ART) chamada LASER ART (Terapia Anti-retroviral de Longa Duração e Lenta Efetividade) (11).

A terapia combinada consiste em utilizar o LASER ART, que suprime a replicação do vírus lentamente no organismo e o CRISPR/Cas9 que consegue editar o genoma de células “reservatório” de vírus HIV, que por estarem latentes (“desativados”) não são afetadas pelo LASER ART. No estudo, os cientistas conseguiram eliminar o vírus HIV em ratos infectados (11).

Outras pesquisas exploram a aplicação terapêutica de CRISPR/Cas9 em várias outras doenças, incluindo o vírus influenza, Zika vírus, Dengue, vírus sincicial respiratório (VSR), herpesvírus (HSV) e o poliomavírus neurotrópico humano (JC) (12, 13, 14).

Além disso, várias infecções virais, como o vírus da hepatite B (HBV), o vírus Epstein-Barr (EBV) e o papilomavírus humano (HPV), estão relacionadas ao desenvolvimento alguns tipos de câncer, como câncer de fígado e de colo de útero. Diversos estudos também têm utilizado o CRISPR/Cas9 como estratégia para tratamento desses tipos de câncer, através da inativação do genoma do vírus ou pela inibição da sua replicação (15, 16, 17).

 

Doenças genéticas

A descoberta do sistema CRISPR/Cas9 revolucionou a engenharia genética e trouxe esperança para o tratamento e cura de muitas doenças. Além das aplicações descritas nos tópicos acima, atualmente, o CRISPR/Cas9 também tem sido utilizado em estudos visando o desenvolvimento de terapia gênica para diversas doenças genéticas. 

Diferentes estudos em camundongos demonstraram o potencial do CRISPR/Cas9 para corrigir surdez, distrofia muscular de Duchenne, hemofilia e deficiência da alfa1-antitripsina (18, 19, 20, 21).

Um exemplo promissor é a terapia baseada em transplante de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) corrigidas por CRISPR/Cas9 em pacientes com anemia falciforme e a beta talassemia, doenças causadas por mutações no gene da hemoglobina (HBB) (22, 23, 24). 

Através do CRISPR/Cas9 os cientistas conseguiram editar o gene HBB das células dos pacientes e recuperar a função normal da hemoglobina. Estudos clínicos estão sendo realizados para comprovar a segurança e eficácia desse tratamento (22, 23, 24).

 

Limitações 

De fato, o CRISPR/Cas9 é a grande esperança da medicina atualmente. Apesar desses (e outros) avanços que o CRISPR/Cas9 trouxe para o mundo e da rápida expansão dos estudos visando o desenvolvimento de novas terapias, muitas pesquisas ainda são necessárias para avaliar a eficiência e, principalmente, a segurança de utilizar essa técnica em humanos.

Estudos também demonstraram que muitas vezes, o sistema CRISPR/Cas9 erra o alvo e acaba editando outras regiões do genoma. Esse acontecimento é chamado de “off-targets” (fora do alvo) e é um importante fator limitante do uso do CRISPR/Cas9 in vivo em humanos. Ainda  é preciso entender como o sistema atua dentro do nosso organismo e quais as consequências de editar nosso genoma, para nós e para as futuras gerações.

Além disso, a edição do DNA levanta muitas questões éticas importantes. Comitês de ética do mundo todo têm discutido a aplicação da edição de genes em embriões. 

Obs: Para entender melhor como o sistema CRISPR/Cas9 atua, sugerimos esse vídeo


Referências

  1. https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/
  2. https://science.sciencemag.org/content/337/6096/816.full
  3. El-Mounadi K, Morales-Floriano ML, Garcia-Ruiz H. Principles, Applications, and Biosafety of Plant Genome Editing Using CRISPR-Cas9. Front Plant Sci. 2020 Feb 13;11:56.
  4. Sun, J., Wang, J., Zheng, D., & Hu, X. (2019). Advances in therapeutic application of CRISPR-Cas9. Briefings in Functional Genomics. doi:10.1093/bfgp/elz031
  5. Jiang C, Meng L, Yang B, et al. Application of CRISPR/Cas9 gene editing technique in the study of cancer treatment. Clin Genet 2019. 
  6. Stadtmauer EA, Fraietta JA, Davis MM, Cohen AD, Weber KL, Lancaster E, Mangan PA, Kulikovskaya I, Gupta M, Chen F, Tian L, Gonzalez VE, Xu J, Jung IY, Melenhorst JJ, Plesa G, Shea J, Matlawski T, Cervini A, Gaymon AL, Desjardins S, Lamontagne A, Salas-Mckee J, Fesnak A, Siegel DL, Levine BL, Jadlowsky JK, Young RM, Chew A, Hwang WT, Hexner EO, Carreno BM, Nobles CL, Bushman FD, Parker KR, Qi Y, Satpathy AT, Chang HY, Zhao Y, Lacey SF, June CH. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 2020 Feb 28;367(6481):eaba7365. 
  7. Garfall AL, Maus MV, Hwang WT, et al. Chimeric antigen receptor T cells against CD19 for multiple myeloma. N Engl J Med 2015;373:1040–7.
  8.  Samson M, Libert F, Doranz BJ, et al. Resistance to HIV-1infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature 1996;382:722–5
  9.  Kang H, Minder P, Park MA, et al.CCR5 disruption in induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9 provides selective resistance of immune cells to CCR5-tropic HIV-1 virus. Mol Ther Nucleic Acids 2015;4:e268.
  10. https://www.sciencemag.org/news/2019/12/chinese-scientist-who-produced-genetically-altered-babies-sentenced-3-years-jail
  11. Dash, P.K., Kaminski, R., Bella, R. et al. Sequential LASER ART and CRISPR Treatments Eliminate HIV-1 in a Subset of Infected Humanized Mice. Nat Commun 10, 2753 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-10366-y
  12. van Diemen FR, Kruse EM, Hooykaas MJ, et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Herpesviruses limits productive and latent infections. PLoS Pathog 2016;12:e1005701.
  13. Wollebo HS, Bellizzi A, Kaminski R, et al. CRISPR/Cas9 system as an agent for eliminating Polyomavirus JC infection.PLoS One 2015;10:e0136046.
  14. Li Y, Muffat J, Omer Javed A, Keys HR, Lungjangwa T, Bosch I, Khan M, Virgilio MC, Gehrke L, Sabatini DM, Jaenisch R. Genome-wide CRISPR screen for Zika virus resistance in human neural cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 May 7;116(19):9527-9532
  15. Ramanan V, Shlomai A, Cox DB, et al. CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Sci Rep 2015;5: 10833.
  16. Yuen KS, Chan CP, Wong NH, et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein–Barr virus in human cells. J GenVirol 2015;96:626–36.
  17. Sanchez-Rivera FJ, Jacks T. Applications of the CRISPR-Cas9 system in cancer biology. Nat Rev Cancer 2015;15:387–95.
  18. Nelson CE, Wu Y, Gemberling MP, Oliver ML, Waller MA, Bohning JD, Robinson-Hamm JN, Bulaklak K, Castellanos Rivera RM, Collier JH, Asokan A, Gersbach CA. Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy. Nat Med. 2019 Mar;25(3):427-432. 
  19. Wang D, Zhang G, Gu J, et al. Vivo generated hematopoietic stem cells from genome edited induced pluripotent stem cells are functional in platelet-targeted gene therapy of murine hemophilia A. Haematologica 2019. pii: haematol.2019.219089. 
  20. György B, Nist-Lund C, Pan B, Asai Y, Karavitaki KD, Kleinstiver BP, Garcia SP, Zaborowski MP, Solanes P, Spataro S, Schneider BL, Joung JK, Géléoc GSG, Holt JR, Corey DP. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nat Med. 2019 Jul;25(7):1123-1130. doi: 10.1038/s41591-019-0500-9. Epub 2019 Jul 3. PMID: 31270503; PMCID: PMC6802276.
  21. Bjursell M, Porritt MJ, Ericson E, Taheri-Ghahfarokhi A, Clausen M, Magnusson L, Admyre T, Nitsch R, Mayr L, Aasehaug L, Seeliger F, Maresca M, Bohlooly-Y M, Wiseman J. Therapeutic Genome Editing With CRISPR/Cas9 in a Humanized Mouse Model Ameliorates α1-antitrypsin Deficiency Phenotype. EBioMedicine. 2018 Mar;29:104-111. 
  22. Huang X,Wang Y, Yan W, et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells 2015;33:1470–9. 
  23. Park SH, Lee CM, Dever DP, et al. Highly efficient editing of the beta-globin gene in patient-derived hematopoietic stem and progenitor cells to treat sickle cell disease. Nucleic Acids Res 2019;47(15):7955–7972. 
  24. Song B, Fan Y, He W, et al. Improved hematopoietic differentiation efficiency of gene-corrected beta-thalassemia induced pluripotent stem cells by CRISPR/Cas9 system. Stem Cells Dev 2015;24:1053–65.

 

Abertura de protocolo do #PARECOVID (RT-LAMP)

Abertura de protocolo do #PARECOVID (RT-LAMP)

Entenda como o teste #PARECOVID (RT-LAMP) é realizado

Métodos de testagem escaláveis e econômicos são uma ferramenta essencial para controlar a disseminação de SARS-CoV-2 e impedir novos surtos da COVID-19. 

Com a missão de democratizar o acesso a testes para COVID-19 para todos que necessitam, desde junho, a Mendelics oferece um teste molecular de desenvolvimento próprio chamado #PARECOVID. Através da estratégia de RT-LAMP, o teste mostra se a pessoa está infectada pela identificação do RNA do vírus SARS-CoV-2 na saliva. O #PARECOVID é o teste de maior capacidade lançado no Brasil até o momento, com capacidade de testagem diária de 30.000 amostras, e os resultados são disponibilizados em até 24 horas. 

Desde 2000 o RT-LAMP já foi utilizado para o diagnóstico de Zika, Influenza, Ebola, Dengue, entre várias outras doenças infecciosas (1-4). No Brasil o RT-LAMP foi adaptado pela primeira vez para a detecção do SARS-CoV-2 pela Mendelics. O protocolo desenvolvido pelo laboratório também introduz outras duas importantes inovações: validação em amostra de saliva e não requer etapa de extração RNA do vírus.

A validação do #PARECOVID, realizada em parceria com o Hospital Sírio Libanês, foi feita com testagem paralela de RT-PCR, técnica padrão-ouro para diagnóstico da COVID-19. A comparação de resultados de amostras de 244 pacientes sintomáticos mostrou que o RT-LAMP tem sensibilidade para detecção do vírus equivalente ao RT-PCR (78,9% vs. 85,5%) e especificidade de 100%. O protocolo e as etapas da validação do teste foram publicados esta semana, em um artigo da plataforma internacional de conteúdo científico medRxiv (5). 

O teste de RT-LAMP desenvolvido pela Mendelics é rápido (o protocolo completo pode ser executado em 3 horas), preciso (detecta o vírus nos estágios iniciais da infecção) e tem custo acessível. O método depende de reagentes que não estão em falta no mercado e de equipamentos já utilizados por grande parte dos laboratórios, facilitando sua reprodução em todo o mundo.  A divulgação  do protocolo permite que outros laboratórios se juntem aos esforços para que o número de testes possa chegar a centenas de milhares por dia.

Acompanhe abaixo os principais pontos esclarecidos pela publicação do protocolo, que também pode ser acessado clicando aqui.  

Como foi feita a coleta das amostras usadas na validação do teste?

As 244 amostras usadas na validação do teste foram coletadas de pacientes do Hospital Sirio Libanês que apresentavam sintomas sugestivos de COVID-19.  As amostras foram coletadas entre um a sete dias após o início dos sintomas. 

Para o teste de RT-PCR foi feita a coleta de amostra nasofaríngea com auxílio de swab estéril e o processamento foi realizado em laboratório clínico independente. A coleta de saliva para o RT-LAMP foi feita pelo próprio paciente e as amostras foram testadas na Mendelics por RT-LAMP entre um a três dias após a coleta. O RNA do SARS-CoV-2 foi identificado por pelo menos um dos dois métodos em 31% dos pacientes (76/244).

 

Como foi feita a etapa de RT-LAMP?

O método de RT-LAMP combina duas técnicas: a transcriptase reversa (RT) e o LAMP.  Na etapa de Transcriptase reversa (RT) o RNA do SARS-CoV-2, se presente, é transformado em cDNA (DNA complementar). A amplificação do cDNA do vírus no LAMP foi feita em temperatura fixa, por cerca de uma hora, em um termociclador convencional. O alvo da amplificação foi o gene Nucleocapsid, escolhido por apresentar um maior número de cópias que outros segmentos do genoma do vírus.  

Para amplificação da região-alvo foram usados  três pares de primers.  O uso de mais de um par de primers torna a reação mais rápida, pois forma novos sítios para início da amplificação a partir da criação de estruturas de loop.  

 

Como foi feita a análise dos resultados?

Os resultados do RT-LAMP foram analisados por fluorescência e Bioanalyzer e também foram confirmados por análise de curva de dissociação em equipamento de PCR em tempo real. A estratégia de confirmação garante a identificação de baixas cargas virais em amostras consideradas negativas na primeira análise e aumenta a especificidade de detecção do SARS-CoV-2.

 

Qual o limite de detecção do teste?

O teste é capaz de detectar o RNA do SARS-CoV-2 em concentrações de  2.5 cópias per μl, considerando 8 ml de saliva. O limite de detecção foi estabelecido na validação por meio da diluição seriada de RNA sintético do SARS-CoV-2.

 

Qual a sensibilidade e especificidade do teste?

–  O RT-LAMP identificou 60 dos 76 infectados (sensibilidade de 78.9%) 

–  Não foram identificados falsos-positivos, ou seja, todos os resultados positivos foram de pacientes infectados pela COVID-19 (especificidade de 100%). 

 

Os resultados do RT-LAMP são equivalentes ao RT-PCR?

O RT-PCR identificou 65 dos 76 pacientes infectados, por isso, apresentou  sensibilidade de 85.5% (vs os 78.9% do RT-LAMP).  Dezesseis pacientes positivos foram identificados apenas no RT-PCR e 11 pacientes positivos foram identificados apenas por RT-LAMP. 

Embora o RT-PCR tenha sensibilidade superior ao RT-LAMP, as diferenças entre as duas técnicas não foram consideradas estatisticamente significativas, conforme demonstrado na publicação.

 

Qual a vantagem de usar saliva em comparação a amostra nasofaríngea?

A maioria dos testes diagnósticos de COVID-19, como o RT-PCR, são feitos a partir da coleta de swab nasofaríngeo, no qual um cotonete é introduzido na garganta ou no nariz do paciente. Além do desconforto que a coleta causa nos pacientes, há também o risco de contaminação para os profissionais de saúde. Como resultado da enorme demanda mundial, o kit de coleta de swab também está em falta no mercado, o que contribui para a limitação da capacidade de testagem no Brasil.

A saliva é uma alternativa segura ao swab nasofaríngeo, já que a coleta não é invasiva e pode ser feita pelo próprio paciente.  A escolha da saliva foi embasada em artigos que demonstraram que a saliva é tão eficaz quanto amostras nasofaríngeas para identificar o SARS-CoV-2 (6,7,8).  

 

Por que foi importante eliminar a etapa de extração de RNA do protocolo do RT-LAMP?

A maioria dos testes diagnósticos para COVID-19 exigem uma etapa de extração do material genético do vírus que, embora contribua para o aumento de sensibilidade do teste, traz vários problemas. Além de impactar no tempo total de entrega do resultado, a extração introduz outros gargalos:  falta de reagentes, dificuldades técnicas envolvidas na extração seja ela automatizada ou manual e custos adicionais. 

A etapa laboratorial do RT-LAMP da Mendelics é realizada diretamente a partir da amostra de saliva do paciente, o que contribui para redução do custo e tempo de entrega do teste. 

 

Esse é o único protocolo de validação de RT-LAMP para COVID-19?

Não. Desde maio de 2020 vários grupos de pesquisa e alguns laboratórios clínicos também publicaram protocolos baseados em RT-LAMP para diagnóstico SARS-CoV-2 (9-19). Mas a maioria depende de coleta de amostra nasofaríngea com swab e extração de RNA, que conforme previamente destacado, são duas etapas problemáticas dos testes. 

 

A publicação do protocolo do RT-LAMP representou um grande marco para a Ciência brasileira e para o combate à pandemia no país e no mundo.

Quer saber mais sobre o teste?

 

A Mendelics conta uma equipe dedicada exclusivamente ao suporte de clientes #PARECOVID. Entre em contato conosco pelo telefone (11) 4637-4356 ou acesse nosso site para que possamos auxiliá-lo no retorno seguro da sua empresa ou centro educacional.

 


Referências

  1. Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
  2. Wang X, Yin F, Bi Y, et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods. 2016;238:86‐93.4
  3. Poon, LLM. et al. 2005. “Detection of Human Influenza A Viruses by Loop-Mediated Isothermal Amplification.” Journal of Clinical Microbiology 43 (1): 427–30.
  4. Kurosaki, YNF. Magassouba, and O. K. Oloniniyi. 2Development and Evaluation of Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay Coupled with a Portable Device for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease in Guinea. PLoS Negl Trop Dis 2016 Feb 22;10(2):e0004472. 
  5. Asprino et al. A Scalable Saliva-based, Extraction-free RT-LAMP Protocol for SARS-Cov-2 Diagnosis, https://doi.org/10.1101/2020.10.27.20220541
  6. Wyllie, Anne L. et al. 2020. “Saliva or Nasopharyngeal Swab Specimens for Detection of SARS-CoV-2.”The New England Journal of Medicine 383 (13): 1283–86.
  7. Wyllie, A L, et al. 2020. “Saliva Is More Sensitive for SARS-CoV-2 Detection in COVID-19 Patients than Nasopharyngeal Swabs.” Medrxiv. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.16.20067835v1
  8. Vogels et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. medRxiv 2020.08.03.20167791; 
  9. Color Genomics SARS-CoV-2 RT-LAMP Diagnostic Assay EUA Summary; September 22, 2020 https://www.fda.gov/media/138249/download
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Mendelics possui acreditações CAP, Inmetro e PALC

Mendelics possui acreditações CAP, Inmetro e PALC

Mendelics é sinônimo de qualidade

Desde 2017, a Mendelics é um laboratório acreditado pelo College of American Pathologists (CAP #8671464), o mais importante programa internacional de acreditação de laboratórios clínicos e líder mundial em ensaios de proficiência.

Como parte do programa de acreditação, todos os processos do laboratório, incluindo coleta, triagem, etapa laboratorial (extração de DNA, preparação de biblioteca e sequenciamento), bioinformática, análise de variantes genéticas, laudo, calibração de aparelhos, rastreabilidade de processos, armazenamento de dados e capacitação da equipe, atendem aos requisitos do CAP.

Os testes de proficiência de genética molecular regularmente executados garantem que todos os nossos exames de sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing, NGS) atendam aos critérios de excelência de qualidade exigidos pelo CAP.

Laboratórios acreditados pelo CAP também são auditados regularmente por inspetores internacionais especialistas em genômica. Em sua mais recente inspeção, em 2019, a Mendelics teve a acreditação renovada pelo CAP por mais dois anos e foi classificada como “World class laboratory”.

A Mendelics também é acreditada pela Coordenação Geral de Acreditação do Inmetro de acordo com a ABNT NBR ISO 15189 e pelo Programa de Acreditação de Laboratórios Clínicos (PALC- #32290508).

 

Diagnóstico genético e a Mendelics

missão da Mendelics é oferecer exames genéticos complexos a preços acessíveis, democratizar o acesso ao diagnóstico genético e divulgar a importância dos exames genéticos entre os médicos, operadoras de saúde e pacientes.

Dúvidas sobre nossos exames? Deixe sua pergunta nos comentários abaixo ou entre em contato com a nossa equipe pelo telefone (11) 5096-6001 ou através do nosso site.

 

Mendelics para pesquisa

Mendelics para pesquisa

O futuro do diagnóstico genético depende da pesquisa científica

A última década foi marcada pelas grandes inovações que a Genética trouxe para a Medicina. Todos esses avanços são resultado do trabalho de gerações de Pesquisadores, que movidos pela curiosidade científica e pela incansável busca por respostas, dedicaram as suas vidas para desenvolver melhores protocolos em Biologia Molecular e para compreender o mecanismo genético de milhares de doenças. 

A Mendelics, laboratório pioneiro de Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing, NGS) do Brasil e líder de diagnóstico de doenças raras e câncer hereditário, compreende a imensa contribuição da Academia para o trabalho que realizamos diariamente.  Por isso, em 2019, implantamos o “Mendelics para Pesquisa”, um setor dedicado exclusivamente a atender demandas de pesquisadores acadêmicos.

Todas as etapas de processamento das amostras e a qualidade de sequenciamento da Mendelics atendem aos critérios do College of American Pathologists (CAP), acreditação que o laboratório detém. 

Também adotamos uma política especial de preços para garantir que todos os pesquisadores possam desenvolver suas pesquisas, mesmo diante dos grande cortes orçamentários que estão ocorrendo nos últimos anos.

O futuro do diagnóstico genético depende da pesquisa científica. Entre em contato conosco para que possamos auxiliá-los no suporte de projetos de pesquisa de sequenciamento.