Entenda as técnicas de NGS Targeted Sequencing

Entenda as técnicas de NGS Targeted Sequencing

O que é NGS targeted sequencing


As técnicas de sequenciamento de nova geração (do inglês Next Generation Sequencing, NGS) desenvolvidas nas últimas décadas permitiram o sequenciamento de genomas completos de vários indivíduos simultaneamente, diminuindo de maneira significativa o custo e tempo das análises. A tecnologia de target sequencing (sequenciamento alvo), permite selecionar regiões específicas do genoma (regiões alvo, geralmente genes específicos,  que vão compor uma biblioteca), tornando as análises ainda mais rápidas e menos custosas.

Quanto a estratégia utilizada para seleção das regiões de interesse (sequências alvo), o NGS por ser dividido em dois tipos: Sequenciamento baseado em Amplicons (Amplicon-based Sequencing – sequenciamento por amplificação em emulsão) e Sequenciamento por Hibridização e Captura (Hybridization-based Capture Sequencing).

Entenda mais sobre NGS nesse artigo.

Sequenciamento por Amplificação

Nessa técnica, as regiões do DNA que serão analisadas são selecionadas utilizando primers específicos. Esses primers são pequenas sequências de bases que se complementam com as regiões de interesse no DNA. Os fragmentos selecionados são, então, amplificados por PCR para aumentar o número de cópias na biblioteca e facilitar a detecção. Chamamos essas cópias de amplicons.

Os primers utilizados, além de selecionar as regiões do DNA que serão analisadas, também adicionam adaptadores nas extremidades dos amplicons. Esses adaptadores contém os índices (sequência curta de bases que identificam cada amostra), e sequências complementares aos primers da flowcell (placa onde ocorre o sequenciamento), utilizados no sequenciamento (Figura 1).

 

Figura 1: A técnica de Sequenciamento por Amplificação resulta em uma cobertura pouco uniforme e perdas de variantes por dropout.

 

Apesar de ser uma técnica mais simples e barata existem algumas desvantagens:

  1. Cada região de interesse necessita de um par de primers específico, o que limita a quantidade de regiões que podem ser analisadas simultaneamente por esse tipo de técnica (1,2).
  2. A ligação do primer à fita de DNA ocorre em uma temperatura específica que pode variar para cada par de primers. Por isso, alguns amplicons vão ser multiplicados com mais facilidade e eficiência que outros, resultando em coberturas (número de vezes que uma região é representada) desiguais das diferentes regiões de interesse (1,2).
  3. Os primers precisam ser complementares à fita de DNA onde vão se ligar. A presença de variações (mutações) pode impedir a amplificação (exclusão alélica, ou dropout, em inglês). Eventos dropout podem resultar tanto na perda da cobertura, quando nem a cópia materna nem a paterna são amplificadas, quanto na genotipagem equivocada de homozigotos (indivíduos com duas cópias iguais de um ponto de variação), quando somente uma cópia é sequenciada, diminuindo a acurácia da técnica (1,2).

 

Sequenciamento por Hibridização e Captura

Nessa técnica o DNA é fragmentado em pedaços menores que se sobrepõem. Os fragmentos contendo as regiões de interesse são ligados aos adaptadores que possuem os índices de identificação das amostras e as sequências complementares aos primers da flowcell. Esses fragmentos são, então, hibridizados (ligados) a sondas que possuem uma molécula de biotina aderida à elas, e é utilizada para capturar os fragmentos de interesse.

O Sequenciamento por Hibridização e Captura não faz uso de amplicons (Figura 2) para enriquecer a biblioteca com as regiões de interesse, dessa forma, os problemas encontrados nas análises de Sequenciamento por Amplificação são sanados.

  1. O Sequenciamento por Hibridização e Captura consegue capturar todas as regiões de interesse (não ocorre exclusão alélica), apresentando maior sensibilidade e acurácia (1,2).
  2. Apresenta cobertura mais homogênea dos fragmentos sequenciados, além de possibilitar o sequenciamento de uma quantidade virtualmente infinita de regiões de interesse (1,2,3)

 

ngs targeted sequencing sequenciamento por hibridização

Figura 2: A Técnica de Sequenciamento por Hibridização e Captura leva à uma cobertura mais homogênea das regiões de interesse.

 

Assim, apesar da técnica de Sequenciamento por Hibridização e Captura ser mais complexa e poder apresentar custo mais elevado, ela permite uma análise mais sensível e acurada dos genes de interesse. Por isso, a Mendelics utiliza kits de preparo de bibliotecas de Sequenciamento por Hibridização e Captura para as análises e diagnóstico genético.

 


Referências

  1. G. Matthijs et al., “Guidelines for diagnostic next-generation sequencing”, European Journal of Human Genetics, vol. 24, no. 1, pp. 2–5, Oct. 2015, doi: 10.1038/ejhg.2015.226.
  2. E. Samorodnitsky et al., “Evaluation of hybridization capture versus Amplicon‐Based methods for Whole‐Exome sequencing”, Human Mutation, vol. 36, no. 9, pp. 903–914, Jul. 2015, doi: 10.1002/humu.22825.
  3. S. S. Hung et al., “Assessment of capture and amplicon-based approaches for the development of a targeted next-generation sequencing pipeline to personalize lymphoma management,” The Journal of Molecular Diagnostics, vol. 20, no. 2, pp. 203–214, Mar. 2018, doi: 10.1016/j.jmoldx.2017.11.010.
Um ano de pandemia da COVID-19: O que aprendemos?

Um ano de pandemia da COVID-19: O que aprendemos?

Tópicos

1. Um ano de pandemia 
2. Um breve histórico da doença 
3. O que aprendemos?
   - Isolamento social
   - Uso de Máscaras
   - Vacinação
   - Novas variantes
   - Testagem em massa
   - Porcentagem de testes positivos para COVID-19 
   - Novas variantes x sensibilidade dos testes
4. Esperança

 

Um ano de pandemia 

Há um ano, em março de 2020, a Organização Mundial da Saúde (OMS) declarava que a COVID-19 era uma pandemia. Na mesma semana, o Brasil registrou a primeira morte pela doença e, após um ano, superamos a marca de mais de 3 mil mortes diárias (1).

Muitos estudos sobre o novo coronavírus foram realizados desde então e mais de 100 vacinas começaram a ser desenvolvidas, sendo algumas já aprovadas e em uso em diversos países.

Simultaneamente ao desenvolvimento das vacinas, novas variantes do Sars-Cov-2 surgiram, desafiando ainda mais o controle da pandemia e o nosso entendimento sobre a doença.

Hoje, o Brasil é o segundo país do mundo com mais casos e com mais mortes registradas, atrás apenas dos Estados Unidos (2). A esperança mundial está depositada sobre as vacinas, com a expectativa para um retorno ao ‘novo normal’.

 

Um breve histórico da doença

Ilustração Blog Mendelics – Timeline Covid-19

 

O que aprendemos?

A importância da testagem em massa, vacinação, uso de máscara e isolamento social

 

Isolamento social

A importância e eficácia do isolamento social no país pode ser facilmente demonstrada com a experiência de Araraquara (SP) e no Estado do Amazonas, onde houve um aumento de casos repentino, que em poucos dias causou lotação dos hospitais e a taxa de ocupação dos leitos de UTI chegou a 100%, falta de insumos, como oxigênio, e recorde de mortes. 

A prefeitura de Araraquara e o governo do Amazonas decretaram um lockdown rigoroso e após uma semana de confinamento da população geral, tanto a taxa de transmissão quanto a média móvel de casos reduziram (11).

No mundo, países como a Nova Zelândia, Austrália e Coreia do Sul adotaram o lockdown desde o início e conseguiram controlar a dispersão do vírus (2).

 

Uso de Máscaras

No primeiro semestre de 2020 ainda não estava claro a real importância do uso de máscaras. A efetividade do uso das máscaras no controle da COVID-19 foi se mostrando à medida que também compreendemos (e foi comprovado cientificamente) que pessoas assintomáticas e pré-sintomáticas são fortes disseminadores do vírus (5, 7). 

A OMS e o Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos publicaram no último mês (fevereiro de 2021) uma série de recomendações sobre o uso de máscaras, que incluem evidências científicas e vídeos explicativos (5, 12).

 

Vacinação

Em menos de 12 meses após o início da pandemia de COVID-19, vários centros de pesquisa enfrentaram o desafio e desenvolveram vacinas (8).

Agora, o desafio é disponibilizar essas vacinas para pessoas em todo o mundo. 

No Brasil, a vacinação começou logo após a aprovação do uso emergencial da Anvisa (10) e até o momento, cerca de 9% da população recebeu ao menos 1 dose (13). Por enquanto, duas vacinas foram aprovadas para uso emergencial e estão sendo aplicadas: a CoronaVac da Sinovac com o Instituto Butantan e a vacina desenvolvida pela AstraZeneca e pela Universidade de Oxford, em parceria com a Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) (10).

Recentemente, a Anvisa aprovou o pedido de registro da vacina da Pfizer/BioNTech. (10) 

Saiba mais sobre as vacinas aqui.

 

Novas variantes

Mutações em vírus acontecem o tempo todo. Quanto mais pessoas infectadas, mais variantes aparecem. O SARS-CoV-2 acumula cerca de 2 mutações por mês, mas a maioria das novas linhagens não tem impacto real na pandemia (14). 

Porém, no final de 2020, novas linhagens foram encontradas no Reino Unido (B.1.1.7) e na África do Sul (B.1.351) e mostraram ter um impacto significativo (14).

No Brasil, a linhagem SARS-CoV-2 B.1.1.28 está circulando desde fevereiro de 2020 sem grande relevância epidemiológica. Em janeiro de 2021, pesquisadores brasileiros identificaram subgrupos da B.1.1.28 com mutações na proteína S comum àquelas detectadas no Reino Unido e na África do Sul (15, 16).

Atualmente, há pelo menos três variantes que surgiram no Brasil e chamam a atenção: O subgrupo P.1, detectado pela primeira vez em viajantes japoneses retornando do Amazonas; o subgrupo P.2, detectado pela primeira vez no Rio de Janeiro; e a recentemente identificada, N9: todas possuem potenciais mutações na proteína S, a espícula viral que viabiliza a entrada do vírus na célula (15, 16). 

O surgimento de novas variantes classificadas como ‘variantes de preocupação (VOC: Variant of Concern) – variantes que demonstram ser mais  transmissíveis, causarem a COVID-19 mais grave e reduzirem a ação do sistema imune pós-infecção e/ou vacinação, colocaram o Brasil no foco mundial de controle da pandemia (14-17). 

 

Testagem em massa

Ainda no início em 2020, a testagem em massa se mostrava como um possível caminho para o retorno seguro de escolas e empresas. Alguns estudos demonstraram que testes realizados frequentemente em curtos intervalos de tempo e com rapidez na entrega dos resultados ajudariam a identificar assintomáticos e pré-sintomáticos, sendo uma estratégia para reduzir a transmissão da doença e impedir o surgimento de novos surtos (18, 19). 

Com a missão de democratizar o acesso a testes para COVID-19 para todos que necessitam, em junho de 2020, a Mendelics lançou um teste molecular de desenvolvimento próprio chamado #PARECOVID. Através da técnica de RT-LAMP, o teste mostra se a pessoa está infectada pela identificação do RNA do vírus SARS-CoV-2 na saliva (6, 9). 

O #PARECOVID é o teste molecular mais acessível, com qualidade comparável ao RT-PCR, lançado no Brasil até o momento, com capacidade de testagem diária de até 110.000 amostras, e resultados disponibilizados em até 24 horas (6). 

Um recente estudo comparativo publicado na revista científica Lancet Public Health (20) demonstrou que programas de testagem de SARS-CoV-2 mais frequentes e rápidos em comunidades, juntamente ao isolamento de indivíduos positivos, é essencial para mitigar a pandemia de COVID-19.

 

Tabela de porcentagem de testes positivos para COVID-19 semana a semana desde o início da testagem 

Em meados de agosto de 2020, o Brasil iniciou o processo de afrouxamento das medidas de isolamento social, iniciadas em março, quando o número de casos da COVID-19 passou a aumentar exponencialmente

Em outubro, a porcentagem de testes positivos tinha reduzido drasticamente, chegando a uma marca de 1%. Em novembro, após alguns feriados nacionais, essa porcentagem voltou a subir.

Em março de 2021, chegamos ao pior cenário da pandemia: mais de 84 mil casos e quase 4 mil mortes por dia. A taxa de resultados positivos semanal no laboratório chegou ao pico de 5%, refletindo a situação de todo o Estado de São Paulo, que chegou ao colapso nos hospitais. Com isso, o governo decretou medidas mais restritivas em todo o estado de São Paulo e, na última semana, começamos a ver uma queda nos números.

covid semana

Fonte: Dados próprios da Mendelics com base nos testes de #PARECOVID realizados frequentemente em empresas no Brasil, com maior concentração no Estado de São Paulo.

 

Novas variantes x sensibilidade dos testes

Recentemente, o FDA (Food and Drugs Administration) publicou um documento intitulado “Genetic Variants of SARS-CoV-2 May Lead to False Negative Results with Molecular Tests for Detection of SARS-CoV-2 – Letter to Clinical Laboratory Staff and Health Care Providers” (21) onde alerta sobre a capacidade das variantes novas escaparem da detecção dos testes de RT-PCR. No documento, o FDA lista três kits de testes de RT-PCR de grandes fabricantes que demonstraram este risco, dois destes muito usados por grandes laboratórios no Brasil. 

Para contornar esse problema, a Mendelics realizou um estudo aprofundado dos alvos moleculares utilizados na detecção do coronavírus e confirmou que as 3 variantes mais perigosas (B.1.1.7, B.1.351 e P.1 – Inglaterra, África do Sul e Manaus) são detectadas pelo teste #PARECOVID, sem prejuízos à especificidade/sensibilidade do teste.

 

Esperança

Após um ano de pandemia, entendemos que métodos de testagem escaláveis e econômicos, como o #PARECOVID, são uma ferramenta essencial para controlar a disseminação de SARS-CoV-2, aliado aos cuidados básicos de higiene, uso de máscaras e distanciamento social estamos atuando no controle da disseminação do vírus e impedindo novos surtos da COVID-19. 

A esperança para esse novo ano de enfrentamento da pandemia está aliado à vacinação da população.

Proteja a sua saúde e a da sua família.

 


Referências

  1. OMS declara pandemia de coronavirus 
  2. Coronavirus World Map
  3. COVID-19 no Brasil
  4. Sequenciamento do vírus no Brasil em 48h
  5. OMS indica o uso de máscaras
  6. Asprino et al. A Scalable Saliva-based, Extraction-free RT-LAMP Protocol for SARS-Cov-2 Diagnosis, https://doi.org/10.1101/2020.10.27.20220541
  7. Seyed M. et al.The implications of silent transmission for the control of COVID-19 outbreaks. Proceedings of the National Academy of Sciences Jul 2020, 117 (30) 17513-17515. 
  8. Vaccine Tracker 
  9. https://blog.mendelics.com.br/abertura-de-protocolo-do-parecovid-rt-lamp/
  10. https://www.gov.br/anvisa/pt-br/assuntos/paf/coronavirus/vacinas
  11. https://www.gazetadopovo.com.br/republica/lockdown-medidas-restritivas-casos-covid-19-resultados-amazonas-araraquara/
  12. Guidance for Wearing Masks 
  13. https://especiais.g1.globo.com/bemestar/vacina/2021/mapa-brasil-vacina-covid/
  14. SARS-CoV-2 Variant Classifications and Definitions 
  15. Felipe Naveca, Valdinete Nascimento, Victor Souza et al. COVID-19 epidemic in the Brazilian state of Amazonas was driven by long-term persistence of endemic SARS-CoV-2 lineages and the recent emergence of the new Variant of Concern P.1, 25 February 2021, PREPRINT (Version 1) available at Research Square [https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-275494/v1]
  16. Faria NR, et al. Genomics and epidemiology of a novel SARS-CoV-2 lineage in Manaus, Brazil. medRxiv [Preprint]. 2021 Mar 3:2021.02.26.21252554. doi: 10.1101/2021.02.26.21252554. 
  17. https://saude.abril.com.br/medicina/brasil-um-possivel-celeiro-de-novas-variantes-do-coronavirus/
  18.  Paltiel AD, Zheng A, Walensky RP. Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States. JAMA Netw Open. 2020;3(7):e2016818.
  19. Larremore DB, Wilder B, Lester E, et al. Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 surveillance. Preprint. medRxiv. 2020;2020.06.22.20136309
  20. Du Z, Pandey A, et al. Comparative cost-effectiveness of SARS-CoV-2 testing strategies in the USA: a modelling study. Lancet Public Health. 2021 Mar;6(3):e184-e191. doi: 10.1016/S2468-2667(21)00002-5.
  21. Genetic Variants of SARS-CoV-2 May Lead to False Negative Results with Molecular Tests for Detection of SARS-CoV-2 – Letter to Clinical Laboratory Staff and Health Care Providers