Agência Nacional de Saúde Suplementar (ANS)

Agência Nacional de Saúde Suplementar (ANS)

Qual a importância da ANS para o diagnóstico genético?

A ANS (Agência Nacional de Saúde Suplementar) é uma agência reguladora, vinculada ao Ministério da Saúde brasileiro, que normatiza os serviços de saúde suplementar oferecidos no país.

Ou seja, a ANS é responsável por regulamentar o guia de exames que devem ser cobertos pelos planos de saúde, além de propor quais técnicas devem ser utilizadas e quais os requisitos mínimos de qualidade dos resultados.

 

Missão da ANS

Promover a defesa do interesse público na assistência suplementar à saúde, regular as operadoras setoriais – inclusive quanto às suas relações com prestadores e consumidores – e contribuir para o desenvolvimento das ações de saúde no país. 

Assim, a ANS garante que as operadoras forneçam tudo aquilo que é considerado essencial para o monitoramento e manutenção da saúde dos conveniados.

 

Diretrizes da ANS para diagnóstico genético por NGS

As diretrizes estabelecidas para os testes de diagnóstico genético por Sequenciamento de Nova Geração (NGS), são baseadas em diretrizes internacionais publicadas pela EuroGentest, um projeto europeu que visa padronizar o diagnóstico e aconselhamento genético (1).

Seguindo as recomendações da EuroGentest, a ANS determina quais genes devem ser analisados para cada tipo de diagnóstico (genes principais) (2).

O que deve ser analisado em cada gene:

  • Todos os seus éxons (regiões do gene que serão traduzidas em proteína). 
  • Pelo menos seis bases dos íntrons e regiões regulatórias adjacentes.
  • Cada uma dessas regiões deve ser lida pelo menos 20 vezes durante o sequenciamento (cobertura).
Imagem representando as regiões analisadas de um gene no diagnóstico genético. Comparação entre as especificações da ANS e a análise da Mendelics.

Regiões analisadas de um gene no diagnóstico genético.

 

As diretrizes também permitem que outros genes de interesse para o diagnóstico sejam incluídos nos painéis, assim os testes genéticos podem acompanhar os avanços da ciência.

Muitos dos testes de diagnóstico genético da Mendelics analisam genes extras, além dos determinados pela ANS. Com isso, a Mendelics cumpre os padrões de qualidade exigidos pela agência, porém com uma capacidade de diagnóstico superior aos painéis comuns, já que analisa mais regiões.

 

Exemplos de diferenças entre a lista de genes listados pela ANS e analisados pela Mendelics:

Exemplos de diferenças entre a lista de genes listados pela ANS e os analisados pela Mendelics

A Mendelics foi pioneira no diagnóstico genético por NGS na América Latina e possui acreditações nacionais e internacionais de qualidade que mostram que os seus resultados são seguros e confiáveis.

Conheça todo o portfólio de exames genéticos no site da Mendelics.

 


Referências

(1) G. Matthijs et al., “Guidelines for diagnostic next-generation sequencing”, European Journal of Human Genetics, vol. 24, no. 1, pp. 2–5, Oct. 2015.

(2) O que é o Rol de Procedimentos e Evento em Saúde. Acesso em 14 de abril de 2021.

Entenda as técnicas de NGS Targeted Sequencing

Entenda as técnicas de NGS Targeted Sequencing

O que é NGS targeted sequencing


As técnicas de sequenciamento de nova geração (do inglês Next Generation Sequencing, NGS) desenvolvidas nas últimas décadas permitiram o sequenciamento de genomas completos de vários indivíduos simultaneamente, diminuindo de maneira significativa o custo e tempo das análises. A tecnologia de target sequencing (sequenciamento alvo), permite selecionar regiões específicas do genoma (regiões alvo, geralmente genes específicos,  que vão compor uma biblioteca), tornando as análises ainda mais rápidas e menos custosas.

Quanto a estratégia utilizada para seleção das regiões de interesse (sequências alvo), o NGS por ser dividido em dois tipos: Sequenciamento baseado em Amplicons (Amplicon-based Sequencing – sequenciamento por amplificação em emulsão) e Sequenciamento por Hibridização e Captura (Hybridization-based Capture Sequencing).

Entenda mais sobre NGS nesse artigo.

Sequenciamento por Amplificação

Nessa técnica, as regiões do DNA que serão analisadas são selecionadas utilizando primers específicos. Esses primers são pequenas sequências de bases que se complementam com as regiões de interesse no DNA. Os fragmentos selecionados são, então, amplificados por PCR para aumentar o número de cópias na biblioteca e facilitar a detecção. Chamamos essas cópias de amplicons.

Os primers utilizados, além de selecionar as regiões do DNA que serão analisadas, também adicionam adaptadores nas extremidades dos amplicons. Esses adaptadores contém os índices (sequência curta de bases que identificam cada amostra), e sequências complementares aos primers da flowcell (placa onde ocorre o sequenciamento), utilizados no sequenciamento (Figura 1).

 

Figura 1: A técnica de Sequenciamento por Amplificação resulta em uma cobertura pouco uniforme e perdas de variantes por dropout.

 

Apesar de ser uma técnica mais simples e barata existem algumas desvantagens:

  1. Cada região de interesse necessita de um par de primers específico, o que limita a quantidade de regiões que podem ser analisadas simultaneamente por esse tipo de técnica (1,2).
  2. A ligação do primer à fita de DNA ocorre em uma temperatura específica que pode variar para cada par de primers. Por isso, alguns amplicons vão ser multiplicados com mais facilidade e eficiência que outros, resultando em coberturas (número de vezes que uma região é representada) desiguais das diferentes regiões de interesse (1,2).
  3. Os primers precisam ser complementares à fita de DNA onde vão se ligar. A presença de variações (mutações) pode impedir a amplificação (exclusão alélica, ou dropout, em inglês). Eventos dropout podem resultar tanto na perda da cobertura, quando nem a cópia materna nem a paterna são amplificadas, quanto na genotipagem equivocada de homozigotos (indivíduos com duas cópias iguais de um ponto de variação), quando somente uma cópia é sequenciada, diminuindo a acurácia da técnica (1,2).

 

Sequenciamento por Hibridização e Captura

Nessa técnica o DNA é fragmentado em pedaços menores que se sobrepõem. Os fragmentos contendo as regiões de interesse são ligados aos adaptadores que possuem os índices de identificação das amostras e as sequências complementares aos primers da flowcell. Esses fragmentos são, então, hibridizados (ligados) a sondas que possuem uma molécula de biotina aderida à elas, e é utilizada para capturar os fragmentos de interesse.

O Sequenciamento por Hibridização e Captura não faz uso de amplicons (Figura 2) para enriquecer a biblioteca com as regiões de interesse, dessa forma, os problemas encontrados nas análises de Sequenciamento por Amplificação são sanados.

  1. O Sequenciamento por Hibridização e Captura consegue capturar todas as regiões de interesse (não ocorre exclusão alélica), apresentando maior sensibilidade e acurácia (1,2).
  2. Apresenta cobertura mais homogênea dos fragmentos sequenciados, além de possibilitar o sequenciamento de uma quantidade virtualmente infinita de regiões de interesse (1,2,3)

 

ngs targeted sequencing sequenciamento por hibridização

Figura 2: A Técnica de Sequenciamento por Hibridização e Captura leva à uma cobertura mais homogênea das regiões de interesse.

 

Assim, apesar da técnica de Sequenciamento por Hibridização e Captura ser mais complexa e poder apresentar custo mais elevado, ela permite uma análise mais sensível e acurada dos genes de interesse. Por isso, a Mendelics utiliza kits de preparo de bibliotecas de Sequenciamento por Hibridização e Captura para as análises e diagnóstico genético.

 


Referências

  1. G. Matthijs et al., “Guidelines for diagnostic next-generation sequencing”, European Journal of Human Genetics, vol. 24, no. 1, pp. 2–5, Oct. 2015, doi: 10.1038/ejhg.2015.226.
  2. E. Samorodnitsky et al., “Evaluation of hybridization capture versus Amplicon‐Based methods for Whole‐Exome sequencing”, Human Mutation, vol. 36, no. 9, pp. 903–914, Jul. 2015, doi: 10.1002/humu.22825.
  3. S. S. Hung et al., “Assessment of capture and amplicon-based approaches for the development of a targeted next-generation sequencing pipeline to personalize lymphoma management,” The Journal of Molecular Diagnostics, vol. 20, no. 2, pp. 203–214, Mar. 2018, doi: 10.1016/j.jmoldx.2017.11.010.
Abertura de protocolo do #PARECOVID (RT-LAMP)

Abertura de protocolo do #PARECOVID (RT-LAMP)

Entenda como o teste #PARECOVID (RT-LAMP) é realizado

Métodos de testagem escaláveis e econômicos são uma ferramenta essencial para controlar a disseminação de SARS-CoV-2 e impedir novos surtos da COVID-19. 

Com a missão de democratizar o acesso a testes para COVID-19 para todos que necessitam, desde junho, a Mendelics oferece um teste molecular de desenvolvimento próprio chamado #PARECOVID. Através da estratégia de RT-LAMP, o teste mostra se a pessoa está infectada pela identificação do RNA do vírus SARS-CoV-2 na saliva. O #PARECOVID é o teste de maior capacidade lançado no Brasil até o momento, com capacidade de testagem diária de 30.000 amostras, e os resultados são disponibilizados em até 24 horas. 

Desde 2000 o RT-LAMP já foi utilizado para o diagnóstico de Zika, Influenza, Ebola, Dengue, entre várias outras doenças infecciosas (1-4). No Brasil o RT-LAMP foi adaptado pela primeira vez para a detecção do SARS-CoV-2 pela Mendelics. O protocolo desenvolvido pelo laboratório também introduz outras duas importantes inovações: validação em amostra de saliva e não requer etapa de extração RNA do vírus.

A validação do #PARECOVID, realizada em parceria com o Hospital Sírio Libanês, foi feita com testagem paralela de RT-PCR, técnica padrão-ouro para diagnóstico da COVID-19. A comparação de resultados de amostras de 244 pacientes sintomáticos mostrou que o RT-LAMP tem sensibilidade para detecção do vírus equivalente ao RT-PCR (78,9% vs. 85,5%) e especificidade de 100%. O protocolo e as etapas da validação do teste foram publicados esta semana, em um artigo da plataforma internacional de conteúdo científico medRxiv (5). 

O teste de RT-LAMP desenvolvido pela Mendelics é rápido (o protocolo completo pode ser executado em 3 horas), preciso (detecta o vírus nos estágios iniciais da infecção) e tem custo acessível. O método depende de reagentes que não estão em falta no mercado e de equipamentos já utilizados por grande parte dos laboratórios, facilitando sua reprodução em todo o mundo.  A divulgação  do protocolo permite que outros laboratórios se juntem aos esforços para que o número de testes possa chegar a centenas de milhares por dia.

Acompanhe abaixo os principais pontos esclarecidos pela publicação do protocolo, que também pode ser acessado clicando aqui.  

Como foi feita a coleta das amostras usadas na validação do teste?

As 244 amostras usadas na validação do teste foram coletadas de pacientes do Hospital Sirio Libanês que apresentavam sintomas sugestivos de COVID-19.  As amostras foram coletadas entre um a sete dias após o início dos sintomas. 

Para o teste de RT-PCR foi feita a coleta de amostra nasofaríngea com auxílio de swab estéril e o processamento foi realizado em laboratório clínico independente. A coleta de saliva para o RT-LAMP foi feita pelo próprio paciente e as amostras foram testadas na Mendelics por RT-LAMP entre um a três dias após a coleta. O RNA do SARS-CoV-2 foi identificado por pelo menos um dos dois métodos em 31% dos pacientes (76/244).

 

Como foi feita a etapa de RT-LAMP?

O método de RT-LAMP combina duas técnicas: a transcriptase reversa (RT) e o LAMP.  Na etapa de Transcriptase reversa (RT) o RNA do SARS-CoV-2, se presente, é transformado em cDNA (DNA complementar). A amplificação do cDNA do vírus no LAMP foi feita em temperatura fixa, por cerca de uma hora, em um termociclador convencional. O alvo da amplificação foi o gene Nucleocapsid, escolhido por apresentar um maior número de cópias que outros segmentos do genoma do vírus.  

Para amplificação da região-alvo foram usados  três pares de primers.  O uso de mais de um par de primers torna a reação mais rápida, pois forma novos sítios para início da amplificação a partir da criação de estruturas de loop.  

 

Como foi feita a análise dos resultados?

Os resultados do RT-LAMP foram analisados por fluorescência e Bioanalyzer e também foram confirmados por análise de curva de dissociação em equipamento de PCR em tempo real. A estratégia de confirmação garante a identificação de baixas cargas virais em amostras consideradas negativas na primeira análise e aumenta a especificidade de detecção do SARS-CoV-2.

 

Qual o limite de detecção do teste?

O teste é capaz de detectar o RNA do SARS-CoV-2 em concentrações de  2.5 cópias per μl, considerando 8 ml de saliva. O limite de detecção foi estabelecido na validação por meio da diluição seriada de RNA sintético do SARS-CoV-2.

 

Qual a sensibilidade e especificidade do teste?

–  O RT-LAMP identificou 60 dos 76 infectados (sensibilidade de 78.9%) 

–  Não foram identificados falsos-positivos, ou seja, todos os resultados positivos foram de pacientes infectados pela COVID-19 (especificidade de 100%). 

 

Os resultados do RT-LAMP são equivalentes ao RT-PCR?

O RT-PCR identificou 65 dos 76 pacientes infectados, por isso, apresentou  sensibilidade de 85.5% (vs os 78.9% do RT-LAMP).  Dezesseis pacientes positivos foram identificados apenas no RT-PCR e 11 pacientes positivos foram identificados apenas por RT-LAMP. 

Embora o RT-PCR tenha sensibilidade superior ao RT-LAMP, as diferenças entre as duas técnicas não foram consideradas estatisticamente significativas, conforme demonstrado na publicação.

 

Qual a vantagem de usar saliva em comparação a amostra nasofaríngea?

A maioria dos testes diagnósticos de COVID-19, como o RT-PCR, são feitos a partir da coleta de swab nasofaríngeo, no qual um cotonete é introduzido na garganta ou no nariz do paciente. Além do desconforto que a coleta causa nos pacientes, há também o risco de contaminação para os profissionais de saúde. Como resultado da enorme demanda mundial, o kit de coleta de swab também está em falta no mercado, o que contribui para a limitação da capacidade de testagem no Brasil.

A saliva é uma alternativa segura ao swab nasofaríngeo, já que a coleta não é invasiva e pode ser feita pelo próprio paciente.  A escolha da saliva foi embasada em artigos que demonstraram que a saliva é tão eficaz quanto amostras nasofaríngeas para identificar o SARS-CoV-2 (6,7,8).  

 

Por que foi importante eliminar a etapa de extração de RNA do protocolo do RT-LAMP?

A maioria dos testes diagnósticos para COVID-19 exigem uma etapa de extração do material genético do vírus que, embora contribua para o aumento de sensibilidade do teste, traz vários problemas. Além de impactar no tempo total de entrega do resultado, a extração introduz outros gargalos:  falta de reagentes, dificuldades técnicas envolvidas na extração seja ela automatizada ou manual e custos adicionais. 

A etapa laboratorial do RT-LAMP da Mendelics é realizada diretamente a partir da amostra de saliva do paciente, o que contribui para redução do custo e tempo de entrega do teste. 

 

Esse é o único protocolo de validação de RT-LAMP para COVID-19?

Não. Desde maio de 2020 vários grupos de pesquisa e alguns laboratórios clínicos também publicaram protocolos baseados em RT-LAMP para diagnóstico SARS-CoV-2 (9-19). Mas a maioria depende de coleta de amostra nasofaríngea com swab e extração de RNA, que conforme previamente destacado, são duas etapas problemáticas dos testes. 

 

A publicação do protocolo do RT-LAMP representou um grande marco para a Ciência brasileira e para o combate à pandemia no país e no mundo.

Quer saber mais sobre o teste?

 

A Mendelics conta uma equipe dedicada exclusivamente ao suporte de clientes #PARECOVID. Entre em contato conosco pelo telefone (11) 4637-4356 ou acesse nosso site para que possamos auxiliá-lo no retorno seguro da sua empresa ou centro educacional.

 


Referências

  1. Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
  2. Wang X, Yin F, Bi Y, et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods. 2016;238:86‐93.4
  3. Poon, LLM. et al. 2005. “Detection of Human Influenza A Viruses by Loop-Mediated Isothermal Amplification.” Journal of Clinical Microbiology 43 (1): 427–30.
  4. Kurosaki, YNF. Magassouba, and O. K. Oloniniyi. 2Development and Evaluation of Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay Coupled with a Portable Device for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease in Guinea. PLoS Negl Trop Dis 2016 Feb 22;10(2):e0004472. 
  5. Asprino et al. A Scalable Saliva-based, Extraction-free RT-LAMP Protocol for SARS-Cov-2 Diagnosis, https://doi.org/10.1101/2020.10.27.20220541
  6. Wyllie, Anne L. et al. 2020. “Saliva or Nasopharyngeal Swab Specimens for Detection of SARS-CoV-2.”The New England Journal of Medicine 383 (13): 1283–86.
  7. Wyllie, A L, et al. 2020. “Saliva Is More Sensitive for SARS-CoV-2 Detection in COVID-19 Patients than Nasopharyngeal Swabs.” Medrxiv. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.16.20067835v1
  8. Vogels et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. medRxiv 2020.08.03.20167791; 
  9. Color Genomics SARS-CoV-2 RT-LAMP Diagnostic Assay EUA Summary; September 22, 2020 https://www.fda.gov/media/138249/download
  10. Lalli MA. et al. 2020. “Rapid and Extraction-Free Detection of SARS-CoV-2 from Saliva with Colorimetric LAMP.” medRxiv : The Preprint Server for Health Sciences, May. https://doi.org/10.1101/2020.05.07.20093542.
  11. Huang WE, Lim B, Hsu CC, et al. RT-LAMP for rapid diagnosis of coronavirus SARS-CoV-2. Microb Biotechnol. 2020;13(4):950-961. 
  12. Yu L, Wu S, Hao X, et al. Rapid Detection of COVID-19 Coronavirus Using a Reverse Transcriptional Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Diagnostic Platform. Clin Chem. 2020;66(7):975-977. 
  13. Park GS, Ku K, Baek SH, et al. Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays Targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). J Mol Diagn. 2020;22(6):729-735.
  14. Kashir J, Yaqinuddin A. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) assays as a rapid diagnostic for COVID-19. Med Hypotheses. 2020;141:109786.
  15. Lu R, Wu X, Wan Z, Li Y, Jin X, Zhang C. A Novel Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of SARS-CoV-2. Int J Mol Sci. 2020;21(8):2826
  16. Jiang M, Pan W, Arasthfer A, et al. Development and Validation of a Rapid, Single-Step Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) System Potentially to Be Used for Reliable and High-Throughput Screening of COVID-19. Front Cell Infect Microbiol. 2020;10:331.
  17. Yan C, Cui J, Huang L, et al. Rapid and visual detection of 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) by a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Clin Microbiol Infect.
  18. Baek YH, Um J, Antigua KJC, et al. Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification as a rapid early-detection method for novel SARS-CoV-2. Emerg Microbes Infect. 2020;9(1):998-1007.
  19. Lamb LE, Bartolone SN, Ward E, Chancellor MB. Rapid detection of novel coronavirus/Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. PLoS One. 2020;15(6):e0234682. 
  20. Dao Thi VL, Herbst K, Boerner K, et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples [published online ahead of print, 2020 Jul 27].
Mendelics é sinônimo de inovação

Mendelics é sinônimo de inovação

A inovação está no nosso DNA

 

Tendo assumido o pioneirismo do diagnóstico genético no Brasil, a Mendelics desenvolveu soluções inovadoras para cada uma das etapas do complexo fluxo de exames de Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing, NGS). 

 

Qualidade 

  • A Mendelics é acreditado pelo College of American Pathologists (CAP #8671464), o mais importante programa internacional de acreditação de laboratórios clínicos.  A Mendelics está acreditada desde 2017 junto ao CAP sob o número 8671464. 

 

  • O Sistema de Gestão de Qualidade da Mendelics também atende a Norma ABNT NBR NM ISO 15189:2015 do INMETRO, que especifica os requisitos para a qualidade e competência em laboratórios clínicos no Brasil.  A Mendelics está acreditada desde 2018 sob o número CLC 0007.

 

Logística 

  • Nossos exames podem ser coletados em sangue (tubo EDTA) ou mucosa bucal com o auxílio de um swab estéril.  Fomos o primeiro laboratório no país a realizar exames genéticos de NGS em amostra de swab bucal. A coleta com esse dispositivo é indolor, rápida e não invasiva e pode ser realizada pelo próprio paciente ou coletada no consultório médico. 

 

  • Também inovamos com estabelecimento de um sistema de logística reversa que atende toda a América Latina.  Os kits de coleta contendo o tubo coletor são enviados gratuitamente para os nossos clientes e as amostras são enviadas de volta para o laboratório por Sedex Reverso.

* Mais informações sobre como solicitar exames, clique aqui.

 

Laboratório

  • Com a maior capacidade de sequenciamento por NGS da América Latina, o laboratório conta com o sequenciador NovaSeq 6000 System (IlluminaⓇ) e processa mensalmente milhares de amostras de toda a América Latina. 

 

Análise dos Resultados e laudos

  • Nosso time de bioinformatas desenvolveu pipeline de análise que seguem as recomendações de melhores práticas do GATK (Broad Institute). Esse pipelines são constantemente submetidos a verificação de qualidade pelo CAP, garantindo assim máxima confiabilidade dos resultados.

 

  • Fomos o primeiro laboratório no Brasil a incluir análise de CNV (Variações no número de cópias, Copy Number Variation) em exames de NGS. Para isso, nossa equipe realizou extensa comparação laboratorial entre dados de MLPA (Amplificação Multiplex de Sondas Dependente de Ligação) e NGS.

 

  • A Mendelics se destaca no mercado laboratorial por ter desenvolvido a plataforma Abracadabra®  que usa inteligência artificial para tornar as análises genéticas mais precisas e eficientes. O Abracadabra® é reconhecido internacionalmente como uma das melhores ferramentas de análises genéticas e é de uso exclusivo da Mendelics.

 

  • Todos  nossos os exames são laudados exclusivamente por médicos geneticistas, com larga experiência e reputação na área de análise genômica.