Sequenciamento Sanger: vantagens para a medicina contemporânea

Sequenciamento Sanger: vantagens para a medicina contemporânea

Entenda mais sobre a técnica de sequenciamento Sanger, que possibilitou o sequenciamento do primeiro genoma humano e como ela ainda é importante 20 anos depois.

 

História do Sequenciamento Sanger

A tecnologia de sequenciamento Sanger surgiu na década de 70 e foi o primeiro grande passo para o sequenciamento massivo de DNA, sendo conhecida hoje como sequenciamento de primeira geração. Essa foi a tecnologia que permitiu o lançamento do Projeto Genoma Humano em 1991, que prometia sequenciar o primeiro genoma humano nos 15 anos seguintes.

Em 2001, o Projeto Genoma Humano publicava o rascunho do primeiro genoma humano, 4 anos antes do previsto, graças ao Sanger e ao desenvolvimento de técnicas de sequenciamento massivo em paralelo, também conhecido como Sequenciamento de Nova Geração (NGS), que teve início na década de 1990.

 

Sequenciamento Sanger x Sequenciamento de Nova Geração

A tecnologia NGS é hoje a principal ferramenta utilizada para sequenciamento na área diagnóstica. Com ela é possível sequenciar várias regiões do DNA, e várias amostras, ao mesmo tempo, reduzindo muito o custo da análise por amostra. No entanto, esse tipo de ensaio tem suas limitações, que podem, em muitos casos, ser sanadas pela tecnologia Sanger.

Na imagem abaixo é possível ver que, com NGS, o DNA é quebrado em pequenos fragmentos, que são sequenciados e depois realinhados através de ferramentas de bioinformática, como um grande quebra-cabeças. Isso dificulta analisar regiões homólogas (semelhantes) e repetitivas do DNA por NGS, pois não sabemos onde encaixar esses fragmentos.

Ilustração comparando a análise de regiões homólogas (semelhantes) por sequenciamento de nova geração (NGS) e por sequenciamento Sanger

Figura 1. Comparação entre análises de regiões homólogas por Sequenciamento de Nova Geração (NGS) e por Sequenciamento Sanger.

Esse problema pode ser resolvido sequenciando fragmentos mais longos, que compreendam as regiões flanqueadoras (regiões que cercam esses trechos). Com peças maiores, é mais fácil resolver o quebra-cabeça.

Enquanto o NGS analisa fragmentos de até 300 pares de bases (pb), o sequenciamento Sanger permite analisar fragmentos que chegam a cerca de 800pb, sendo mais indicado para a análise de regiões complexas.

O sequenciamento tipo Sanger utiliza alguns nucleotídeos modificados com fluoróforos (moléculas que emitem luminescência), e resulta em cópias com diferentes tamanhos da sequência do DNA de interesse, mas que se iniciam na mesma posição, como mostrado na figura abaixo.

Os fragmentos são separados por tamanho e as bases finais de cada cópia são identificadas pela fluorescência.

Ilustração de como é feito o sequenciamento sanger, onde os nucleotídeos alterados com fluoróforos identificam a inserção de cada base que compõe a sequência

Figura 2. Sequenciamento Sanger. Os fragmentos sequenciados são identificados por tamanho e pela fluorescência emitida pela última case adicionada. Dessa forma é possível determinar a sequência de nucleotídeos da região de interesse.

 

Dessa forma, o sequenciamento Sanger permite identificar variantes genéticas em sequências mais longas de DNA, sem a necessidade de uma etapa computacional de reconstrução dos trechos sequenciados.

 

Sanger no diagnóstico de doenças causadas por regiões complexas

Um bom exemplo do uso do sequenciamento Sanger na medicina atual é no diagnóstico da Hiperplasia Adrenal Congênita (CAH) resultante da deficiência da enzima 21-hidroxilase.

Essa doença leva à produção excessiva de hormônios andrógenos (masculinos), podendo causar o desenvolvimento de genitália ambígua em pessoas do sexo feminino, além de puberdade precoce em ambos os sexos.

Cerca de 75% dos casos também apresenta deficiência do hormônio aldosterona, que leva à dificuldade de reter água e sais, causando desidratação, baixo volume de sangue circulante (hipovolemia) e pressão baixa (hipotensão).

A CAH com deficiência de 21-hidrogenase é causada por alterações no gene CYP21A2, que possui um pseudogene homólogo, o CYP21A1P. Esse pseudogene é uma região do DNA muito semelhante ao gene CYP21A2, porém não é funcional, ou seja, a partir dele não é possível produzir a enzima 21-hidroxilase.

Durante a formação dos gametas ocorrem alguns eventos de recombinação do DNA, nos quais os pares de cromossomos se recombinam resultando em sequências híbridas daquelas que herdamos dos nossos pais. Durante esse processo, regiões homólogas (CYP21A2 e CYP21A1P, por exemplo) podem ser indevidamente pareadas e, consequentemente, trocadas durante a recombinação.

Como mostrado na figura abaixo, tanto a troca de regiões entre o gene CYP21A2 e o pseudogene CYP21A1P, quanto a união deles (resultado de uma deleção) podem comprometer a produção da 21-hidrogenase. Cerca de 95% das alterações genéticas que levam à CAH são resultantes de recombinações entre as regiões homólogas.

Ilustração dos eventos de recombinação e deleção na região do gene CYP21A2 e do pseudogene CYP21A1P que resultam em Hiperplasia Adrenal Congênita (CAH) com deficiência da enzima 21-hidroxilase.

Figura 3. Ilustração dos eventos de recombinação e deleção na região do gene CYP21A2 e do pseudogene CYP21A1P que resultam em Hiperplasia Adrenal Congênita (CAH) com deficiência da enzima 21-hidroxilase.

O sequenciamento de Sanger é capaz de identificar essas recombinações e atingir uma taxa diagnóstica mais alta que os painéis de NGS, que não conseguem sequenciar toda a região de interesse em uma única sequência. Por isso, Sanger é a metodologia mais indicada para o diagnóstico de CAH com deficiência de 21-hidrogenase.

Na Mendelics o diagnóstico da Hiperplasia Adrenal Congênita resultante da deficiência da enzima 21-hidroxilase é feito por Sanger e MLPA, para a identificação das variantes resultantes de recombinações e das deleções, respectivamente, atingindo uma alta taxa diagnóstica para a doença.

Conheça o exame

 

Consulte sempre seu médico e, se precisar de um exame diagnóstico, entre em contato com a nossa equipe.


Referências

Khan Academy – Sequenciamento de DNA

National Human Genome Research Institute (NHGRI) – DNA Sequencing Costs: Data

National Organization for Rare Disorders – Congenital Adrenal Hyperplasia

Nimkarn S, et al. 21-Hydroxylase-Deficient Congenital Adrenal Hyperplasia. 2002. In: Adam MP, et al., editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2021.

Pignatelli D., et al. The complexities in genotyping of congenital adrenal hyperplasia: 21-Hydroxylase deficiency. 2019. Frontiers in Endocrinology, vol. 10.

Diagnóstico genético por CGH-array e SNP-array

Diagnóstico genético por CGH-array e SNP-array

CGH-array e SNP-array entenda as técnicas de análise cromossômica por microarray

 

O que é a hibridação cromossômica em microarray

A hibridação cromossômica em microarray é uma técnica de biologia molecular que investiga simultaneamente milhares de regiões no genoma humano para identificar a presença de variações no número de cópias (Copy Number Variations, CNVs). 

As CNVs abrangem as microdeleções (perda de material genético) e microduplicações (ganho de material genético) maiores do que 1kb (1.000 pares de bases) (Figura 1). Perdas ou ganhos no nosso genoma, que incluem um ou vários genes, são a causa de milhares de doenças genéticas. 

deleção duplicação cariotipo

FIgura 1: Ilustração demonstrando o que é uma microduplicação (a região ‘B’ foi duplicada) e uma microdeleção (a região ‘B’ foi perdida) em um cromossomo.

 

A hibridação cromossômica em microarray investiga o genoma com uma capacidade de resolução muito superior ao exame de cariótipo, sendo capaz de identificar microdeleções e microduplicações que não são detectadas no cariótipo. 

Por isso os exames de microarray, CGH-array e SNP-array, tem sido cada vez mais utilizados na prática clínica para o diagnóstico genético, principalmente para esclarecer quadro clínicos de causa desconhecida, e que podem ter causa genética. Exemplos: malformações congênitas, deficiência intelectual, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e transtorno do Espectro Autista (TEA ou autismo).

 

Qual a diferença entre o CGH-array e SNP-array?

Existem dois tipos de hibridação cromossômica em microarrays: o CGH-array (Hibridização Genômica Comparativa – Comparative Genomic Hybridization, CGH) e o SNP-array (Polimorfismos de nucleotídeo único – Single Nucleotide Polymorphisms, SNP). 

Ambos os microarrays conseguem identificar CNVs, porém o SNP-array detecta também regiões de ausência de heterozigose (absence of heterozygosity – AOH) no genoma.

As regiões AOH podem estar associadas a um tipo de alteração genética chamada de dissomia uniparental (UPD).  A UPD ocorre quando um par de cromossomo inteiro ou um segmento cromossômico foi herdado do mesmo genitor.  

As síndrome de Prader-Willi, síndrome  de Angelman e síndrome de Silver-Russell são exemplos de doenças genéticas que pode ser causadas por UPD. 

 

Quais as diferenças entre os exames de microarray e cariótipo?

Com o advento das técnicas de hibridação cromossômica em microarrays, na primeira metade da década de 2000, muitos se perguntaram se o exame de cariótipo ia ser substituído pelo CGH-array e SNP-array.

Mas 15 anos após a disponibilização das primeiras plataformas de microarray, o cariótipo ainda é bastante utilizado no Brasil, seja por obrigatoriedade da análise escalonada da ANS (Agência Nacional de Saúde Suplementar) ou por limitações da técnica de microarray.

Por isso, é muito importante saber para que serve o cariótipo e em quais situações o exame pode ser complementado ou substituído pelo microarray

 

1) Para que serve o cariótipo?

O cariótipo é uma técnica de citogenética que estuda os cromossomos humanos. O exame de cariótipo é identifica alterações no número total de cromossomos (aneuploidias), grandes deleções e duplicações, e rearranjos equilibrados.

 

Aneuploidias:  

As aneuploidias são definidas pela ausência de um cromossomo (monossomia), ou pela presença de uma ou mais cópias de um cromossomo inteiro (Exemplo: trissomia).  

As aneuploidias mais conhecidas são: a síndrome de Down (trissomia do cromossomo 21), a síndrome de Patau (trissomia do 13), a síndrome de Edwards (trissomia do 18); a síndrome de Klinefelter  (47, XXY) e a síndrome de Turner (monossomia do 21). 

 

Grandes deleções e duplicações cromossômicas

As grandes deleções e duplicações causam, respectivamente, perdas e ganhos de grandes segmentos cromossômicos. Elas podem incluir braços inteiros de cromossomos ou abranger segmentos menores. 

Nesse último caso as alterações só serão detectadas pelo cariótipo se puderem ser visualizadas em um microscópio óptico. Caso contrário, somente técnicas de maior resolução, como o microarray, podem detectá-las.  

 

Rearranjos equilibrados

Nos rearranjos equilibrados há troca de posição de segmentos cromossômicos, sem perda ou ganhos (Exemplo: translocações e inversões). 

A maioria das pessoas que possuem rearranjos equilibrados são clinicamente normais. Porém, elas têm risco aumentado de abortos espontâneos, infertilidade e maior chance de ter filhos afetados por doenças genéticas causadas por deleções ou duplicações.

 

2) O microarray complementa ou substitui o cariótipo?

Caso a suspeita clínica seja de anomalia cromossômica que possa ser identificada pelo cariótipo, este é o exame que deve ser solicitado. Um exemplo é a síndrome de Cri-du-chat, onde a perda de um segmento do braço curto do cromossomo 5  que origina a doença pode ser detectada no cariótipo. 

Quando a suspeita é de um rearranjo equilibrado, exemplo de pacientes com histórico de aborto de repetição e infertilidade, recomenda-se também o cariótipo. Rearranjos equilibrados não causam perdas ou ganhos de segmentos e, por isso, não são detectados pelo microarray

Para pacientes com malformações congênitas, deficiência intelectual, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e autismo, o microarray pode ser solicitado após a realização do cariótipo ou como primeiro exame de diagnóstico genético

Nos Estados Unidos a Sociedade Americana de Genética Médica, recomenda a realização da hibridação cromossômica em microarray como primeiro exame genético para esse grupo de pacientes. 

Essa recomendação baseia-se em estudos que mostraram que a taxa diagnóstica da hibridação cromossômica em microarray é de 14-20%, em comparação a 3% do cariótipo (excluindo-se pacientes com síndrome de Down e outras doenças cromossômicas já conhecidas).

Embora a decisão da solicitação inicial do microarray fique a critério médico, no Brasil o Rol de Procedimentos e Eventos em Saúde da ANS, que estabelece a cobertura obrigatória para os beneficiários de planos contratados a partir de 1999, autoriza o microarray somente após a realização dos exames de cariótipo e para Síndrome do X Frágil.  

 

A Mendelics oferece o SNP-array de alta resolução

A Mendelics utiliza a CytoSNP-850K BeadChip (Illumina), uma plataforma de alta densidade que contém 850.000 marcadores distribuídos estrategicamente para garantir ampla cobertura  de regiões clinicamente relevantes do genoma humano

O SNP-array de alta densidade oferece as seguintes vantagens:

  • Alta resolução na identificação de CNVs.
  • Cobertura aumentada em genes sensíveis à dosagem. 
  • Detecção de alterações em mosaico e regiões de ausência de heterozigose (AOH).

Importante: Esse texto tem caráter educativo. É fortemente recomendado que o paciente seja acompanhado por um médico que orientará qual a melhor maneira de se proceder. Converse com seu médico.

Quer saber mais sobre o SNP-array ou CGH-array? Deixe sua pergunta nos comentários abaixo ou entre em contato com a nossa equipe pelo telefone (11) 5096-6001 ou através do nosso site.

 


Referências

  1. Miller DT, Adam MP, Aradhya S, et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am J Hum Genet. 2010;86(5):749-764. 
  2. https://www.anthem.com/dam/medpolicies/abc/active/guidelines/gl_pw_d094176.html
  3. Parecer Técnico Da Sociedade Brasileira De Genética Médica e Genômica Sobre Testes Genéticos. Volume 1. Recomendações Sobre A Qualidade Técnica e Laudo Dos Principais Exames Em Genética Médica. Grupo de Trabalho da Sociedade Brasileira de Genética Médica e Genômica (SBGM) sobre exames genéticos – 2018/2021.