Abertura de protocolo do #PARECOVID (RT-LAMP)

Abertura de protocolo do #PARECOVID (RT-LAMP)

Entenda como o teste #PARECOVID (RT-LAMP) é realizado

Métodos de testagem escaláveis e econômicos são uma ferramenta essencial para controlar a disseminação de SARS-CoV-2 e impedir novos surtos da COVID-19. 

Com a missão de democratizar o acesso a testes para COVID-19 para todos que necessitam, desde junho, a Mendelics oferece um teste molecular de desenvolvimento próprio chamado #PARECOVID. Através da estratégia de RT-LAMP, o teste mostra se a pessoa está infectada pela identificação do RNA do vírus SARS-CoV-2 na saliva. O #PARECOVID é o teste de maior capacidade lançado no Brasil até o momento, com capacidade de testagem diária de 30.000 amostras, e os resultados são disponibilizados em até 24 horas. 

Desde 2000 o RT-LAMP já foi utilizado para o diagnóstico de Zika, Influenza, Ebola, Dengue, entre várias outras doenças infecciosas (1-4). No Brasil o RT-LAMP foi adaptado pela primeira vez para a detecção do SARS-CoV-2 pela Mendelics. O protocolo desenvolvido pelo laboratório também introduz outras duas importantes inovações: validação em amostra de saliva e não requer etapa de extração RNA do vírus.

A validação do #PARECOVID, realizada em parceria com o Hospital Sírio Libanês, foi feita com testagem paralela de RT-PCR, técnica padrão-ouro para diagnóstico da COVID-19. A comparação de resultados de amostras de 244 pacientes sintomáticos mostrou que o RT-LAMP tem sensibilidade para detecção do vírus equivalente ao RT-PCR (78,9% vs. 85,5%) e especificidade de 100%. O protocolo e as etapas da validação do teste foram publicados esta semana, em um artigo da plataforma internacional de conteúdo científico medRxiv (5). 

O teste de RT-LAMP desenvolvido pela Mendelics é rápido (o protocolo completo pode ser executado em 3 horas), preciso (detecta o vírus nos estágios iniciais da infecção) e tem custo acessível. O método depende de reagentes que não estão em falta no mercado e de equipamentos já utilizados por grande parte dos laboratórios, facilitando sua reprodução em todo o mundo.  A divulgação  do protocolo permite que outros laboratórios se juntem aos esforços para que o número de testes possa chegar a centenas de milhares por dia.

Acompanhe abaixo os principais pontos esclarecidos pela publicação do protocolo, que também pode ser acessado clicando aqui.  

Como foi feita a coleta das amostras usadas na validação do teste?

As 244 amostras usadas na validação do teste foram coletadas de pacientes do Hospital Sirio Libanês que apresentavam sintomas sugestivos de COVID-19.  As amostras foram coletadas entre um a sete dias após o início dos sintomas. 

Para o teste de RT-PCR foi feita a coleta de amostra nasofaríngea com auxílio de swab estéril e o processamento foi realizado em laboratório clínico independente. A coleta de saliva para o RT-LAMP foi feita pelo próprio paciente e as amostras foram testadas na Mendelics por RT-LAMP entre um a três dias após a coleta. O RNA do SARS-CoV-2 foi identificado por pelo menos um dos dois métodos em 31% dos pacientes (76/244).

 

Como foi feita a etapa de RT-LAMP?

O método de RT-LAMP combina duas técnicas: a transcriptase reversa (RT) e o LAMP.  Na etapa de Transcriptase reversa (RT) o RNA do SARS-CoV-2, se presente, é transformado em cDNA (DNA complementar). A amplificação do cDNA do vírus no LAMP foi feita em temperatura fixa, por cerca de uma hora, em um termociclador convencional. O alvo da amplificação foi o gene Nucleocapsid, escolhido por apresentar um maior número de cópias que outros segmentos do genoma do vírus.  

Para amplificação da região-alvo foram usados  três pares de primers.  O uso de mais de um par de primers torna a reação mais rápida, pois forma novos sítios para início da amplificação a partir da criação de estruturas de loop.  

 

Como foi feita a análise dos resultados?

Os resultados do RT-LAMP foram analisados por fluorescência e Bioanalyzer e também foram confirmados por análise de curva de dissociação em equipamento de PCR em tempo real. A estratégia de confirmação garante a identificação de baixas cargas virais em amostras consideradas negativas na primeira análise e aumenta a especificidade de detecção do SARS-CoV-2.

 

Qual o limite de detecção do teste?

O teste é capaz de detectar o RNA do SARS-CoV-2 em concentrações de  2.5 cópias per μl, considerando 8 ml de saliva. O limite de detecção foi estabelecido na validação por meio da diluição seriada de RNA sintético do SARS-CoV-2.

 

Qual a sensibilidade e especificidade do teste?

–  O RT-LAMP identificou 60 dos 76 infectados (sensibilidade de 78.9%) 

–  Não foram identificados falsos-positivos, ou seja, todos os resultados positivos foram de pacientes infectados pela COVID-19 (especificidade de 100%). 

 

Os resultados do RT-LAMP são equivalentes ao RT-PCR?

O RT-PCR identificou 65 dos 76 pacientes infectados, por isso, apresentou  sensibilidade de 85.5% (vs os 78.9% do RT-LAMP).  Dezesseis pacientes positivos foram identificados apenas no RT-PCR e 11 pacientes positivos foram identificados apenas por RT-LAMP. 

Embora o RT-PCR tenha sensibilidade superior ao RT-LAMP, as diferenças entre as duas técnicas não foram consideradas estatisticamente significativas, conforme demonstrado na publicação.

 

Qual a vantagem de usar saliva em comparação a amostra nasofaríngea?

A maioria dos testes diagnósticos de COVID-19, como o RT-PCR, são feitos a partir da coleta de swab nasofaríngeo, no qual um cotonete é introduzido na garganta ou no nariz do paciente. Além do desconforto que a coleta causa nos pacientes, há também o risco de contaminação para os profissionais de saúde. Como resultado da enorme demanda mundial, o kit de coleta de swab também está em falta no mercado, o que contribui para a limitação da capacidade de testagem no Brasil.

A saliva é uma alternativa segura ao swab nasofaríngeo, já que a coleta não é invasiva e pode ser feita pelo próprio paciente.  A escolha da saliva foi embasada em artigos que demonstraram que a saliva é tão eficaz quanto amostras nasofaríngeas para identificar o SARS-CoV-2 (6,7,8).  

 

Por que foi importante eliminar a etapa de extração de RNA do protocolo do RT-LAMP?

A maioria dos testes diagnósticos para COVID-19 exigem uma etapa de extração do material genético do vírus que, embora contribua para o aumento de sensibilidade do teste, traz vários problemas. Além de impactar no tempo total de entrega do resultado, a extração introduz outros gargalos:  falta de reagentes, dificuldades técnicas envolvidas na extração seja ela automatizada ou manual e custos adicionais. 

A etapa laboratorial do RT-LAMP da Mendelics é realizada diretamente a partir da amostra de saliva do paciente, o que contribui para redução do custo e tempo de entrega do teste. 

 

Esse é o único protocolo de validação de RT-LAMP para COVID-19?

Não. Desde maio de 2020 vários grupos de pesquisa e alguns laboratórios clínicos também publicaram protocolos baseados em RT-LAMP para diagnóstico SARS-CoV-2 (9-19). Mas a maioria depende de coleta de amostra nasofaríngea com swab e extração de RNA, que conforme previamente destacado, são duas etapas problemáticas dos testes. 

 

A publicação do protocolo do RT-LAMP representou um grande marco para a Ciência brasileira e para o combate à pandemia no país e no mundo.

Quer saber mais sobre o teste?

 

A Mendelics conta uma equipe dedicada exclusivamente ao suporte de clientes #PARECOVID. Entre em contato conosco pelo telefone (11) 4637-4356 ou acesse nosso site para que possamos auxiliá-lo no retorno seguro da sua empresa ou centro educacional.

 


Referências

  1. Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
  2. Wang X, Yin F, Bi Y, et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods. 2016;238:86‐93.4
  3. Poon, LLM. et al. 2005. “Detection of Human Influenza A Viruses by Loop-Mediated Isothermal Amplification.” Journal of Clinical Microbiology 43 (1): 427–30.
  4. Kurosaki, YNF. Magassouba, and O. K. Oloniniyi. 2Development and Evaluation of Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay Coupled with a Portable Device for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease in Guinea. PLoS Negl Trop Dis 2016 Feb 22;10(2):e0004472. 
  5. Asprino et al. A Scalable Saliva-based, Extraction-free RT-LAMP Protocol for SARS-Cov-2 Diagnosis, https://doi.org/10.1101/2020.10.27.20220541
  6. Wyllie, Anne L. et al. 2020. “Saliva or Nasopharyngeal Swab Specimens for Detection of SARS-CoV-2.”The New England Journal of Medicine 383 (13): 1283–86.
  7. Wyllie, A L, et al. 2020. “Saliva Is More Sensitive for SARS-CoV-2 Detection in COVID-19 Patients than Nasopharyngeal Swabs.” Medrxiv. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.16.20067835v1
  8. Vogels et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. medRxiv 2020.08.03.20167791; 
  9. Color Genomics SARS-CoV-2 RT-LAMP Diagnostic Assay EUA Summary; September 22, 2020 https://www.fda.gov/media/138249/download
  10. Lalli MA. et al. 2020. “Rapid and Extraction-Free Detection of SARS-CoV-2 from Saliva with Colorimetric LAMP.” medRxiv : The Preprint Server for Health Sciences, May. https://doi.org/10.1101/2020.05.07.20093542.
  11. Huang WE, Lim B, Hsu CC, et al. RT-LAMP for rapid diagnosis of coronavirus SARS-CoV-2. Microb Biotechnol. 2020;13(4):950-961. 
  12. Yu L, Wu S, Hao X, et al. Rapid Detection of COVID-19 Coronavirus Using a Reverse Transcriptional Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Diagnostic Platform. Clin Chem. 2020;66(7):975-977. 
  13. Park GS, Ku K, Baek SH, et al. Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays Targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). J Mol Diagn. 2020;22(6):729-735.
  14. Kashir J, Yaqinuddin A. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) assays as a rapid diagnostic for COVID-19. Med Hypotheses. 2020;141:109786.
  15. Lu R, Wu X, Wan Z, Li Y, Jin X, Zhang C. A Novel Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of SARS-CoV-2. Int J Mol Sci. 2020;21(8):2826
  16. Jiang M, Pan W, Arasthfer A, et al. Development and Validation of a Rapid, Single-Step Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) System Potentially to Be Used for Reliable and High-Throughput Screening of COVID-19. Front Cell Infect Microbiol. 2020;10:331.
  17. Yan C, Cui J, Huang L, et al. Rapid and visual detection of 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) by a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Clin Microbiol Infect.
  18. Baek YH, Um J, Antigua KJC, et al. Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification as a rapid early-detection method for novel SARS-CoV-2. Emerg Microbes Infect. 2020;9(1):998-1007.
  19. Lamb LE, Bartolone SN, Ward E, Chancellor MB. Rapid detection of novel coronavirus/Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. PLoS One. 2020;15(6):e0234682. 
  20. Dao Thi VL, Herbst K, Boerner K, et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples [published online ahead of print, 2020 Jul 27].
Variações genéticas, sistema ABO e COVID-19

Variações genéticas, sistema ABO e COVID-19

Variações no nosso DNA nos tornam mais susceptíveis à infecção pelo SARS-COV-2?

Estudo sugere potencial associação entre grupo sanguíneo ABO e gravidade de COVID-19

Um dos maiores desafios na atual epidemia de COVID-19 é compreender a grande variabilidade de sintomas associados a infecção por SARS-CoV-2, o vírus que causa a doença. Embora, a maioria das pessoas permaneça assintomática ou desenvolva apenas sintomas leves ou moderados, 4.9% a 11.5% dos infectados  podem ter formas graves e/ou letais da doença (1). 

Há muito tempo já sabemos que a susceptibilidade a patógenos pode ser influenciada por variações no nosso DNA. O melhor exemplo é a mutação “delta-32” no gene CCR5 que confere, a seus portadores, resistência ao HIV quando presente em duas cópias. Pesquisadores do mundo todo se perguntam se situação similar pode ocorrer com a COVID-19

Desde o início da pandemia vários pesquisadores ao redor do mundo conduzem estudos que analisam o DNA de pacientes que foram infectados com o vírus para identificar fatores genéticos que possam explicar a susceptibilidade a infecção e a gravidade da doença. Essas descobertas serão importantes para identificar pacientes com maior ou menor risco, e também podem contribuir para tratamentos mais eficientes e desenvolvimento de vacinas. 

 

Você conhece a COVID-19 Host Genetics Initiative?

 

Nesse contexto a colaboração internacional é fundamental. Um exemplo é o COVID-19 Host Genetics Initiative, um grande esforço de pesquisadores do mundo todo que compartilham resultados de estudos de análises genéticas de pacientes infectados por COVID-19 (2). Os resultados são disponibilizados no site da iniciativa e podem ser acessados por toda a comunidade científica (3). 

No início da pandemia especulava-se que existia relação entre variantes no gene ACE2 e a susceptibilidade à doença. O SARS-CoV-2 usa o receptor de ACE2 para entrar nas células do hospedeiro. Mas até o momento não há dados que confirmem qualquer associação com ACE2. Por outro lado, estudos  sugerem uma possível associação da doença com grupo sanguíneo ABO e outras regiões do nosso genoma. 

 

Estudo sugere potencial associação entre grupo sanguíneo ABO e gravidade de COVID-19

 

Um estudo genético publicado no mês de junho no New England Journal of Medicine (NEJM) sugere um potencial envolvimento do sistema de grupos sanguíneos ABO na COVID-19 (4). Nesse estudo, cientistas usaram uma estratégia chamada GWAS (genome wide association study) para analisar regiões específicas do genoma de 1980 pacientes com COVID-19 e compará-las com o genoma de pessoas saudáveis (grupo controle).

Os pacientes com COVID-19 apresentavam quadros respiratórios graves e estavam internados em hospitais italianos e espanhóis. Os resultados do estudo sugerem uma possível associação entre o grupo sanguíneo A e maior risco de desenvolver quadros mais graves da doença. Os resultados também sugerem um possível efeito protetor do grupo O em comparação aos outros grupos sanguíneos. Outro estudo chinês publicado anteriormente também havia identificado uma possível relação entre grupo ABO e COVID-19 (5).

É importante ressaltar que o artigo do NEJM é apenas um estudo preliminar e que mais estudos com um número maior de pacientes precisam ser publicados para confirmar uma possível associação entre grupos sanguíneos e risco de formas mais graves de COVID-19. 

O estudo também identificou uma segunda região do genoma, no cromossomo 3 (3p21.31), que também parece estar associada a quadros graves da doença e que já tinha sido previamente identificada também no COVID-19 Host Genetics Initiative. Seis genes estão localizados nessa região: SLC6A20, LZTFL1, CCR9, FYCO1, CXCR6 e XCR1. 

Este estudo do NEJM não identificou associação com complexo HLA, região do genoma importante para outras infecções virais. 

Referências

(1) Severe Outcomes Among Patients with Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) — United States, February 12–March 16, 2020. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2020;69:343-346

(2) COVID-19 Host Genetics Initiative. The COVID-19 Host Genetics Initiative, a global initiative to elucidate the role of host genetic factors in susceptibility and severity of the SARS-CoV-2 virus pandemic. Eur J Hum Genet 2020;28:715-718

(3)  https://www.covid19hg.org/

(4) Ellinghaus D, Degenhardt F, Bujanda L, et al. Genomewide Association Study of Severe Covid-19 with Respiratory Failure. N Engl J Med. 2020.

(5) Wu Y, Feng Z, Li P, Yu Q. Relationship between ABO blood group distribution and clinical characteristics in patients with COVID-19. Clin Chim Acta. 2020;509:220-223.