Entienda cómo se realiza la prueba #PARECOVID (RT-LAMP)

Los métodos de testeo escalables y rentables son una herramienta esencial para controlar la propagación del SARS-CoV-2 y prevenir nuevos brotes de COVID-19.

Con la misión de democratizar el acceso a las pruebas de COVID-19 para todos los que lo necesiten, desde junio, Mendelics ofrece una prueba molecular de desarrollo propio llamada #PARECOVID. Mediante la estrategia RT-LAMP, la prueba muestra si la persona está infectada por la identificación del ARN del virus SARS-CoV-2 en la saliva. #PARECOVID es la prueba de capacidad más grande lanzada en Brasil hasta ahora, con una capacidad de prueba diaria de 30.000 muestras, y los resultados están disponibles en 24 horas.

Desde el año 2000, RT-LAMP se ha utilizado para el diagnóstico de Zika, Influenza, Ébola, Dengue, entre varias otras enfermedades infecciosas (1-4). En Brasil, RT-LAMP fue adaptado por primera vez para la detección de SARS-CoV-2 por Mendelics. El protocolo desarrollado por el laboratorio también introduce otras dos innovaciones importantes: la validación en muestra de saliva y no requerir extracción de ARN del virus.

La validación de #PARECOVID, realizada en colaboración con el Hospital Sírio Libanês, 

se hizo con pruebas paralelas de RT-PCR, una técnica patrón de oro para el diagnóstico de COVID-19. La comparación de resultados de las muestras de 244 pacientes sintomáticos mostró que RT-LAMP tiene una sensibilidad para la detección de virus equivalente a RT-PCR (78,9% frente a 85,5%) y una especificidad de 100%. El protocolo y los pasos de validación de la prueba se publicaron esta semana en un artículo de la plataforma internacional de contenido científico medRxiv (5).

La prueba RT-LAMP desarrollada por Mendelics es rápida (el protocolo completo se puede realizar en 3 horas), precisa (detecta el virus en las primeras fases de la infección) y es asequible. El método depende de reactivos que no faltan en el mercado y de equipos ya utilizados por la mayoría de los laboratorios, facilitando su reproducción a nivel mundial. La divulgación del protocolo permite que otros laboratorios unan esfuerzos para que el número de pruebas pueda llegar a cientos de miles por día.

A continuación, los principales puntos aclarados por la publicación del protocolo, al que también se puede cliquear aquí para acceder.

 

¿Cómo se toman las muestras utilizadas en la validación de la prueba?

Las 244 muestras utilizadas en la validación de la prueba se obtuvieron de pacientes del Hospital Sirio Libanês que presentaban síntomas sugerentes de COVID-19. La toma de muestras se realizó entre uno y siete días después del inicio de los síntomas.

Para la prueba de RT-PCR, se tomó muestra nasofaríngea utilizando un swab estéril y el procesamiento se realizó en un laboratorio clínico independiente. La recolección de saliva para RT-LAMP fue realizada por el propio paciente y las muestras fueron analizadas en Mendelics por RT-LAMP entre uno y tres días después de la recolección. El ARN del SARS-CoV-2 se identificó mediante al menos uno de los dos métodos en el 31% de los pacientes (76/244).

 

¿Cómo se realizó el RT-LAMP?

El método RT-LAMP combina dos técnicas: transcriptasa inversa (RT) y LAMP. En el paso de la transcriptasa inversa (RT), el ARN del SARS-CoV-2, si está presente, se transforma en ADNc (ADN complementario). La amplificación del ADN del virus en el LAMP se realizó a una temperatura fija, durante aproximadamente una hora, en un termociclador convencional. El objetivo de la amplificación fue el gen Nucleocapsid, elegido porque tiene un mayor número de copias que otros segmentos del genoma del virus.

Para amplificar la región de interés, se utilizaron tres pares de cebadores. El uso de más de un par de cebadores acelera la reacción, ya que forma nuevos sitios para el inicio de la amplificación creando estructuras de loop.

 

¿Cómo se analizaron los resultados?

Los resultados de RT-LAMP fueron analizados por fluorescencia y Bioanalyzer y también fueron confirmados por análisis de curva de disociación en equipo de PCR en tiempo real. La estrategia de confirmación asegura la identificación de cargas virales bajas en muestras consideradas negativas en el primer análisis y aumenta la especificidad de detección del SARS-CoV-2.

 

¿Cuál es el límite de detección de la prueba?

La prueba es capaz de detectar el ARN del SARS-CoV-2 en concentraciones de 2,5 copias por μl, considerando 8 ml de saliva. El límite de detección se estableció en la validación mediante dilución en serie de ARN sintético del SARS-CoV-2.

 

¿Cuál es la sensibilidad y especificidad de la prueba?

• RT-LAMP identificó 60 de 76 infectados (sensibilidad 78,9%)
• No se identificaron falsos positivos, o sea, todos los resultados positivos fueron de pacientes infectados por COVID-19 (100% de especificidad).

 

¿Son los resultados de RT-LAMP equivalentes a RT-PCR?

RT-PCR identificó a 65 de los 76 pacientes infectados, por tanto presentó una sensibilidad de 85,5% (frente al 78,9% de la RT-LAMP). Se identificaron dieciséis pacientes positivos solo en RT-PCR y 11 pacientes positivos se identificaron solo en RT-LAMP.

Aunque RT-PCR es más sensible que RT-LAMP, las diferencias entre las dos técnicas no se consideraron estadísticamente significativas, como se demuestra en la publicación.

 

¿Cuál es la ventaja de utilizar saliva en comparación con la muestra nasofaríngea?

La mayoría de las pruebas de diagnóstico para COVID-19, como la RT-PCR, se realizan con muestras de swab nasofaríngeo, en el que se inserta un hisopo de algodón en la garganta o la nariz del paciente. Además de las molestias que provoca la recogida en los pacientes, también existe el riesgo de contaminación para los profesionales sanitarios. Como resultado de la gran demanda mundial, el kit de recolección de swab también falta en el mercado, lo que contribuye a la limitación de la capacidad de prueba en Brasil.

La saliva es una alternativa segura al swab nasofaríngeo, ya que la toma de la muestra no es invasiva y puede ser realizada por el propio paciente. La elección de la saliva se basó en artículos que demostraron que la saliva es tan eficaz como las muestras nasofaríngeas para identificar el SARS-CoV-2 (6,7,8).

 

¿Por qué era importante eliminar el paso de extracción de ARN del protocolo RT-LAMP?

La mayoría de las pruebas de diagnóstico para COVID-19 requieren un paso de extracción del material genético del virus que, aunque contribuye a la mayor sensibilidad de la prueba, trae varios problemas. Además de impactar en el tiempo total de entrega del resultado, la extracción introduce otros cuellos de botella: falta de reactivos, dificultades técnicas involucradas en la extracción, sea automatizada o manual, y costos adicionales.

El paso de laboratorio de RT-LAMP de Mendelics se realiza directamente a partir de la muestra de saliva del paciente, lo que contribuye a reducir el costo y el tiempo de entrega de la prueba.

 

¿Es este el único protocolo de validación RT-LAMP para COVID-19?

No. Desde mayo de 2020, varios grupos de investigación y algunos laboratorios clínicos también han publicado protocolos basados ​​en RT-LAMP para diagnosticar el SARS-CoV-2 (9-19). Pero la mayoría depende de la recolección de muestras nasofaríngeas con swab y extracción de ARN, que, como se destacó anteriormente, son dos etapas problemáticas de las pruebas.

La publicación del protocolo RT-LAMP representó un hito importante para la ciencia brasileña y para combatir la pandemia en el país y en el mundo.

 

¿Quieres saber más sobre la prueba?

Mendelics cuenta con un equipo dedicado exclusivamente a apoyar a los clientes de #PARECOVID. Contáctanos por el teléfono (+57) 3228162947 o visite nuestro site para que podamos asistirlo en el regreso seguro de su empresa o centro educativo.

¿Le gustó esta publicación? ¡Compártala en sus redes sociales!

Traducido por Karent Gutierrez

---

Referencias

1. Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
2. Wang X, Yin F, Bi Y, et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods. 2016;238:86‐93.4
3. Poon, LLM. et al. 2005. “Detection of Human Influenza A Viruses by Loop-Mediated Isothermal Amplification.” Journal of Clinical Microbiology 43 (1): 427–30.
4. Kurosaki, YNF. Magassouba, and O. K. Oloniniyi. 2Development and Evaluation of Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay Coupled with a Portable Device for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease in Guinea. PLoS Negl Trop Dis 2016 Feb 22;10(2):e0004472. 
5. Asprino et al. A Scalable Saliva-based, Extraction-free RT-LAMP Protocol for SARS-Cov-2 Diagnosis, https://doi.org/10.1101/2020.10.27.20220541. 
6. Wyllie, Anne L. et al. 2020. “Saliva or Nasopharyngeal Swab Specimens for Detection of SARS-CoV-2.”The New England Journal of Medicine 383 (13): 1283–86.
7. Wyllie, A L, et al. 2020. “Saliva Is More Sensitive for SARS-CoV-2 Detection in COVID-19 Patients than Nasopharyngeal Swabs.” Medrxiv. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.16.20067835v1
8. Vogels et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. medRxiv 2020.08.03.20167791; 
9. Color Genomics SARS-CoV-2 RT-LAMP Diagnostic Assay EUA Summary; September 22, 2020 https://www.fda.gov/media/138249/download
10. Lalli MA. et al. 2020. “Rapid and Extraction-Free Detection of SARS-CoV-2 from Saliva with Colorimetric LAMP.” medRxiv : The Preprint Server for Health Sciences, May. https://doi.org/10.1101/2020.05.07.20093542.
11. Huang WE, Lim B, Hsu CC, et al. RT-LAMP for rapid diagnosis of coronavirus SARS-CoV-2. Microb Biotechnol. 2020;13(4):950-961. 
12. Yu L, Wu S, Hao X, et al. Rapid Detection of COVID-19 Coronavirus Using a Reverse Transcriptional Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Diagnostic Platform. Clin Chem. 2020;66(7):975-977. 
13. Park GS, Ku K, Baek SH, et al. Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays Targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). J Mol Diagn. 2020;22(6):729-735.
14. Kashir J, Yaqinuddin A. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) assays as a rapid diagnostic for COVID-19. Med Hypotheses. 2020;141:109786.
15. Lu R, Wu X, Wan Z, Li Y, Jin X, Zhang C. A Novel Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of SARS-CoV-2. Int J Mol Sci. 2020;21(8):2826
16. Jiang M, Pan W, Arasthfer A, et al. Development and Validation of a Rapid, Single-Step Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) System Potentially to Be Used for Reliable and High-Throughput Screening of COVID-19. Front Cell Infect Microbiol. 2020;10:331.
17. Yan C, Cui J, Huang L, et al. Rapid and visual detection of 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) by a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Clin Microbiol Infect.
18. Baek YH, Um J, Antigua KJC, et al. Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification as a rapid early-detection method for novel SARS-CoV-2. Emerg Microbes Infect. 2020;9(1):998-1007.
19. Lamb LE, Bartolone SN, Ward E, Chancellor MB. Rapid detection of novel coronavirus/Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. PLoS One. 2020;15(6):e0234682. 
20. Dao Thi VL, Herbst K, Boerner K, et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples [published online ahead of print, 2020 Jul 27].