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APERTURA DEL PROTOCOLO #PARECOVID (RT-LAMP)

por | 3 Jan, 2022 | Covid-19, Notícias

ENTIENDA CÓMO SE REALIZA LA PRUEBA #PARECOVID (RT-LAMP)

Los métodos de testeo escalables y rentables son una herramienta esencial para controlar la propagación del SARS-CoV-2 y prevenir nuevos brotes de COVID-19.

Com a missão de democratizar o acesso a testes para COVID-19 para todos que precisam, desde junho de 2020, a Mendelics oferece um teste molecular de desenvolvimento próprio chamado #PARECOVID. Através da estratégia de RT-LAMP, o teste mostra se a pessoa está infectada pela identificação do RNA do vírus SARS-CoV-2 na saliva. O #PARECOVID é o teste de maior capacidade de testagem lançado no Brasil até o momento, com capacidade de testagem diária de 110.000 amostras, e os resultados são disponibilizados em até 24 horas. 

Desde el año 2000, RT-LAMP se ha utilizado para el diagnóstico de Zika, Influenza, Ébola, Dengue, entre varias otras enfermedades infecciosas (1-4). En Brasil, RT-LAMP fue adaptado por primera vez para la detección de SARS-CoV-2 por Mendelics. El protocolo desarrollado por el laboratorio también introduce otras dos innovaciones importantes: la validación en muestra de saliva y no requerir extracción de ARN del virus.

La validación de #PARECOVID, realizada en colaboración con el Hospital Sírio Libanês, se hizo con pruebas paralelas de RT-PCR, una técnica patrón de oro para el diagnóstico de COVID-19. La comparación de resultados de las muestras de 244 pacientes sintomáticos mostró que RT-LAMP tiene una sensibilidad para la detección de virus equivalente a RT-PCR (78,9% frente a 85,5%) y una especificidad de 100%. El protocolo y los pasos de validación de la prueba se publicaron esta semana en un artículo de la plataforma internacional de contenido científico medRxiv (5).

O teste de RT-LAMP desenvolvido pela Mendelics é rápido (o protocolo completo pode ser executado em 3 horas), preciso (detecta o vírus nos estágios iniciais da infecção) e tem custo acessível. O método depende de reagentes que não estão em falta no mercado e de equipamentos já utilizados por grande parte dos laboratórios, facilitando sua reprodução em todo o mundo.  A divulgação do protocolo permite que outros laboratórios se juntem aos esforços para que o número de testes possa chegar a centenas de milhares por dia.

A continuación, los principales puntos aclarados por la publicación del protocolo, al que también se puede cliquear aquí para acceder.

¿Cómo se toman las muestras utilizadas en la validación de la prueba?

Las 244 muestras utilizadas en la validación de la prueba se obtuvieron de pacientes del Hospital Sirio Libanês que presentaban síntomas sugerentes de COVID-19. La toma de muestras se realizó entre uno y siete días después del inicio de los síntomas.

Para la prueba de RT-PCR, se tomó muestra nasofaríngea utilizando un swab estéril y el procesamiento se realizó en un laboratorio clínico independiente. La recolección de saliva para RT-LAMP fue realizada por el propio paciente y las muestras fueron analizadas en Mendelics por RT-LAMP entre uno y tres días después de la recolección. El ARN del SARS-CoV-2 se identificó mediante al menos uno de los dos métodos en el 31% de los pacientes (76/244).

 

Como foi feita a análise por RT-LAMP?

El método RT-LAMP combina dos técnicas: transcriptasa inversa (RT) y LAMP. En el paso de la transcriptasa inversa (RT), el ARN del SARS-CoV-2, si está presente, se transforma en ADNc (ADN complementario). La amplificación del ADN del virus en el LAMP se realizó a una temperatura fija, durante aproximadamente una hora, en un termociclador convencional. El objetivo de la amplificación fue el gen Nucleocapsid, elegido porque tiene un mayor número de copias que otros segmentos del genoma del virus.

Para amplificação da região-alvo foram usados três pares de primers. O uso de mais de um par de primers torna a reação mais rápida, pois forma novos sítios para início da amplificação a partir da criação de estruturas de loop.  

 

¿Cómo se analizaron los resultados?

Os resultados do RT-LAMP foram analisados por fluorescência e eletroforese (2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Inc.) e também foram confirmados por análise de curva de dissociação em equipamento de PCR em tempo real. A estratégia de confirmação garante a identificação de baixas cargas virais em amostras consideradas negativas na primeira análise e aumenta a especificidade de detecção do SARS-CoV-2.

 

¿Cuál es el límite de detección de la prueba?

O teste é capaz de detectar o RNA do SARS-CoV-2 em concentrações de 2.5 cópias per μl, considerando 8 ml de saliva. O limite de detecção foi estabelecido na validação por meio da diluição seriada de RNA sintético do SARS-CoV-2.

 

¿Cuál es la sensibilidad y especificidad de la prueba?

  • O RT-LAMP identificou 60 dos 76 infectados (sensibilidade de 78.9%) 
  • No se identificaron falsos positivos, o sea, todos los resultados positivos fueron de pacientes infectados por COVID-19 (100% de especificidad). 

 

¿Son los resultados de RT-LAMP equivalentes a RT-PCR?

O RT-PCR identificou 65 dos 76 pacientes infectados, por isso, apresentou sensibilidade de 85.5% (vs os 78.9% do RT-LAMP). Dezesseis pacientes positivos foram identificados apenas no RT-PCR e 11 pacientes positivos foram identificados apenas por RT-LAMP. 

Aunque RT-PCR es más sensible que RT-LAMP, las diferencias entre las dos técnicas no se consideraron estadísticamente significativas, como se demuestra en la publicación.

 

¿Cuál es la ventaja de utilizar saliva en comparación con la muestra nasofaríngea?

A maioria dos testes diagnósticos de COVID-19, como o RT-PCR, são feitos a partir da coleta de swab nasofaríngeo, no qual um cotonete é introduzido na garganta ou no nariz do paciente. Além do desconforto que a coleta causa nos pacientes, há também o risco de contaminação para os profissionais de saúde. Adicionalmente, como resultado da enorme demanda mundial, o kit de coleta de swab também está em falta no mercado, o que contribui para a limitação da capacidade de testagem por RT-PCR no Brasil.

A saliva é uma alternativa segura ao swab nasofaríngeo, já que a coleta não é invasiva e pode ser feita pelo próprio paciente. A escolha da saliva foi embasada em artigos que demonstraram que a saliva é tão eficaz quanto amostras nasofaríngeas para identificar o SARS-CoV-2 (6,7,8).  

 

¿Por qué era importante eliminar el paso de extracción de ARN del protocolo RT-LAMP?

A maioria dos testes diagnósticos para COVID-19 exigem uma etapa de extração do material genético do vírus que, embora contribua para o aumento de sensibilidade do teste, traz vários problemas. Além de impactar no tempo total de entrega do resultado, a extração introduz outros gargalos: falta de reagentes, dificuldades técnicas envolvidas na extração seja ela automatizada ou manual, e custos adicionais. 

El paso de laboratorio de RT-LAMP de Mendelics se realiza directamente a partir de la muestra de saliva del paciente, lo que contribuye a reducir el costo y el tiempo de entrega de la prueba. 

 

¿Es este el único protocolo de validación RT-LAMP para COVID-19?

Não. Desde maio de 2020 vários grupos de pesquisa e alguns laboratórios clínicos também publicaram protocolos baseados em RT-LAMP para diagnóstico SARS-CoV-2 (9-19). Mas a maioria depende de coleta de amostra nasofaríngea com swab e extração de RNA que, conforme previamente destacado, são duas etapas problemáticas dos testes. 

La publicación del protocolo RT-LAMP representó un hito importante para la ciencia brasileña y para combatir la pandemia en el país y en el mundo.

Quer saber mais sobre o #PARECOVID? A Mendelics conta uma equipe dedicada exclusivamente ao suporte de clientes #PARECOVID. Entre em contato conosco pelo telefone (11) 4637-4356 ou acesse nosso site para que possamos auxiliá-lo no retorno seguro da sua empresa ou centro educacional.

 


Referencias

  1. Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
  2. Wang X, Yin F, Bi Y, et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods. 2016;238:86‐93.4
  3. Poon, LLM. et al. 2005. “Detection of Human Influenza A Viruses by Loop-Mediated Isothermal Amplification.” Journal of Clinical Microbiology 43 (1): 427–30.
  4. Kurosaki, YNF. Magassouba, and O. K. Oloniniyi. 2Development and Evaluation of Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay Coupled with a Portable Device for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease in Guinea. PLoS Negl Trop Dis 2016 Feb 22;10(2):e0004472. 
  5. Asprino et al. A Scalable Saliva-based, Extraction-free RT-LAMP Protocol for SARS-Cov-2 Diagnosis, https://doi.org/10.1101/2020.10.27.20220541
  6. Wyllie, Anne L. et al. 2020. “Saliva or Nasopharyngeal Swab Specimens for Detection of SARS-CoV-2.”The New England Journal of Medicine 383 (13): 1283–86.
  7. Wyllie, A L, et al. 2020. “Saliva Is More Sensitive for SARS-CoV-2 Detection in COVID-19 Patients than Nasopharyngeal Swabs.” Medrxiv. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.16.20067835v1
  8. Vogels et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. medRxiv 2020.08.03.20167791; 
  9. Color Genomics SARS-CoV-2 RT-LAMP Diagnostic Assay EUA Summary; September 22, 2020 https://www.fda.gov/media/138249/download
  10. Lalli MA. et al. 2020. “Rapid and Extraction-Free Detection of SARS-CoV-2 from Saliva with Colorimetric LAMP.” medRxiv : The Preprint Server for Health Sciences, May. https://doi.org/10.1101/2020.05.07.20093542.
  11. Huang WE, Lim B, Hsu CC, et al. RT-LAMP for rapid diagnosis of coronavirus SARS-CoV-2. Microb Biotechnol. 2020;13(4):950-961. 
  12. Yu L, Wu S, Hao X, et al. Rapid Detection of COVID-19 Coronavirus Using a Reverse Transcriptional Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Diagnostic Platform. Clin Chem. 2020;66(7):975-977. 
  13. Park GS, Ku K, Baek SH, et al. Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays Targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). J Mol Diagn. 2020;22(6):729-735.
  14. Kashir J, Yaqinuddin A. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) assays as a rapid diagnostic for COVID-19. Med Hypotheses. 2020;141:109786.
  15. Lu R, Wu X, Wan Z, Li Y, Jin X, Zhang C. A Novel Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of SARS-CoV-2. Int J Mol Sci. 2020;21(8):2826
  16. Jiang M, Pan W, Arasthfer A, et al. Development and Validation of a Rapid, Single-Step Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) System Potentially to Be Used for Reliable and High-Throughput Screening of COVID-19. Front Cell Infect Microbiol. 2020;10:331.
  17. Yan C, Cui J, Huang L, et al. Rapid and visual detection of 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) by a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Clin Microbiol Infect.
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  20. Dao Thi VL, Herbst K, Boerner K, et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples [published online ahead of print, 2020 Jul 27].

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