Entenda como o teste #PARECOVID (RT-LAMP) é realizado
Métodos de testagem escaláveis e econômicos são uma ferramenta essencial para controlar a disseminação de SARS-CoV-2 e impedir novos surtos da COVID-19.
Com a missão de democratizar o acesso a testes para COVID-19 para todos que precisam, desde junho de 2020, a Mendelics oferece um teste molecular de desenvolvimento próprio chamado #PARECOVID. Através da estratégia de RT-LAMP, o teste mostra se a pessoa está infectada pela identificação do RNA do vírus SARS-CoV-2 na saliva. O #PARECOVID é o teste de maior capacidade de testagem lançado no Brasil até o momento, com capacidade de testagem diária de 110.000 amostras, e os resultados são disponibilizados em até 24 horas.
Desde 2000 o RT-LAMP já foi utilizado para o diagnóstico de Zika, Influenza, Ebola, Dengue, entre várias outras doenças infecciosas (1-4). No Brasil o RT-LAMP foi adaptado pela primeira vez para a detecção do SARS-CoV-2 pela Mendelics. O protocolo desenvolvido pelo laboratório também introduz outras duas importantes inovações: validação em amostra de saliva e não requer etapa de extração RNA do vírus.
A validação do #PARECOVID, realizada em parceria com o Hospital Sírio Libanês, foi feita com testagem paralela de RT-PCR, técnica padrão-ouro para diagnóstico da COVID-19. A comparação de resultados de amostras de 244 pacientes sintomáticos mostrou que o RT-LAMP tem sensibilidade para detecção do vírus equivalente ao RT-PCR (78,9% vs. 85,5%) e especificidade de 100%. O protocolo e as etapas da validação do teste foram publicados esta semana, em um artigo da plataforma internacional de conteúdo científico medRxiv (5).
O teste de RT-LAMP desenvolvido pela Mendelics é rápido (o protocolo completo pode ser executado em 3 horas), preciso (detecta o vírus nos estágios iniciais da infecção) e tem custo acessível. O método depende de reagentes que não estão em falta no mercado e de equipamentos já utilizados por grande parte dos laboratórios, facilitando sua reprodução em todo o mundo. A divulgação do protocolo permite que outros laboratórios se juntem aos esforços para que o número de testes possa chegar a centenas de milhares por dia.
Acompanhe abaixo os principais pontos esclarecidos pela publicação do protocolo, que também pode ser acessado clicando aqui.
Como foi feita a coleta das amostras usadas na validação do teste?
As 244 amostras usadas na validação do teste foram coletadas de pacientes do Hospital Sirio Libanês que apresentavam sintomas sugestivos de COVID-19. As amostras foram coletadas entre um a sete dias após o início dos sintomas.
Para o teste de RT-PCR foi feita a coleta de amostra nasofaríngea com auxílio de swab estéril e o processamento foi realizado em laboratório clínico independente. A coleta de saliva para o RT-LAMP foi feita pelo próprio paciente e as amostras foram testadas na Mendelics por RT-LAMP entre um a três dias após a coleta. O RNA do SARS-CoV-2 foi identificado por pelo menos um dos dois métodos em 31% dos pacientes (76/244).
Como foi feita a análise por RT-LAMP?
O método de RT-LAMP combina duas técnicas: a transcriptase reversa (RT) e o LAMP. Na etapa de Transcriptase reversa (RT) o RNA do SARS-CoV-2, se presente, é transformado em cDNA (DNA complementar). A amplificação do cDNA do vírus no LAMP foi feita em temperatura fixa, por cerca de uma hora, em um termociclador convencional. O alvo da amplificação foi o gene Nucleocapsid, escolhido por apresentar um maior número de cópias que outros segmentos do genoma do vírus.
Para amplificação da região-alvo foram usados três pares de primers. O uso de mais de um par de primers torna a reação mais rápida, pois forma novos sítios para início da amplificação a partir da criação de estruturas de loop.
Como foi feita a análise dos resultados?
Os resultados do RT-LAMP foram analisados por fluorescência e eletroforese (2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Inc.) e também foram confirmados por análise de curva de dissociação em equipamento de PCR em tempo real. A estratégia de confirmação garante a identificação de baixas cargas virais em amostras consideradas negativas na primeira análise e aumenta a especificidade de detecção do SARS-CoV-2.
Qual o limite de detecção do teste?
O teste é capaz de detectar o RNA do SARS-CoV-2 em concentrações de 2.5 cópias per μl, considerando 8 ml de saliva. O limite de detecção foi estabelecido na validação por meio da diluição seriada de RNA sintético do SARS-CoV-2.
Qual a sensibilidade e especificidade do teste?
- O RT-LAMP identificou 60 dos 76 infectados (sensibilidade de 78.9%)
- Não foram identificados falsos-positivos, ou seja, todos os resultados positivos foram de pacientes infectados pela COVID-19 (especificidade de 100%).
Os resultados do RT-LAMP são equivalentes ao RT-PCR?
O RT-PCR identificou 65 dos 76 pacientes infectados, por isso, apresentou sensibilidade de 85.5% (vs os 78.9% do RT-LAMP). Dezesseis pacientes positivos foram identificados apenas no RT-PCR e 11 pacientes positivos foram identificados apenas por RT-LAMP.
Embora o RT-PCR tenha sensibilidade superior ao RT-LAMP, as diferenças entre as duas técnicas não foram consideradas estatisticamente significativas, conforme demonstrado na publicação.
Qual a vantagem de usar saliva em comparação a amostra nasofaríngea?
A maioria dos testes diagnósticos de COVID-19, como o RT-PCR, são feitos a partir da coleta de swab nasofaríngeo, no qual um cotonete é introduzido na garganta ou no nariz do paciente. Além do desconforto que a coleta causa nos pacientes, há também o risco de contaminação para os profissionais de saúde. Adicionalmente, como resultado da enorme demanda mundial, o kit de coleta de swab também está em falta no mercado, o que contribui para a limitação da capacidade de testagem por RT-PCR no Brasil.
A saliva é uma alternativa segura ao swab nasofaríngeo, já que a coleta não é invasiva e pode ser feita pelo próprio paciente. A escolha da saliva foi embasada em artigos que demonstraram que a saliva é tão eficaz quanto amostras nasofaríngeas para identificar o SARS-CoV-2 (6,7,8).
Por que foi importante eliminar a etapa de extração de RNA do protocolo do RT-LAMP?
A maioria dos testes diagnósticos para COVID-19 exigem uma etapa de extração do material genético do vírus que, embora contribua para o aumento de sensibilidade do teste, traz vários problemas. Além de impactar no tempo total de entrega do resultado, a extração introduz outros gargalos: falta de reagentes, dificuldades técnicas envolvidas na extração seja ela automatizada ou manual, e custos adicionais.
A etapa laboratorial do RT-LAMP da Mendelics é realizada diretamente a partir da amostra de saliva do paciente, o que contribui para redução do custo e tempo de entrega do teste.
Esse é o único protocolo de validação de RT-LAMP para COVID-19?
Não. Desde maio de 2020 vários grupos de pesquisa e alguns laboratórios clínicos também publicaram protocolos baseados em RT-LAMP para diagnóstico SARS-CoV-2 (9-19). Mas a maioria depende de coleta de amostra nasofaríngea com swab e extração de RNA que, conforme previamente destacado, são duas etapas problemáticas dos testes.
A publicação do protocolo do RT-LAMP representou um grande marco para a Ciência brasileira e para o combate à pandemia no país e no mundo.
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Referências
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